Aspectos importantes de microbiologia: coleta, preservação de espécimes e noções de biologia molecular Maria Clara Padoveze Divisão de Infecção Hospitalar.

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1 Aspectos importantes de microbiologia: coleta, preservação de espécimes e noções de biologia molecular Maria Clara Padoveze Divisão de Infecção Hospitalar

2 Microbiologia – Surtos de IH
Todo resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é conseqüência da qualidade da amostra recebida. O material coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um resultado inapropriado

3 Microbiologia – Surtos de IH
procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um “falso” agente etiológico Na amostra devem estar identificados: 􀂃 Nome e registro do paciente 􀂃 Leito ou ambulatório e especialidade 􀂃 Material colhido 􀂃 Data, hora e quem realizou a coleta

4 Considerações gerais da coleta
􀂃 Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível. 􀂃 Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos. 􀂃 Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado. 􀂃 Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos causadores de diarréia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarréica do processo infeccioso intestinal. 􀂃 Quantidade suficiente de material deve ser coletado para permitir uma completa análise microbiológica. O pedido do exame deve conter as informações necessárias para o perfeito desenvolvimento da análise clínica do espécime.

5 Considerações de segurança
􀂃 Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento. 􀂃 Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patogênica. 􀂃 Usar frascos e meios de transporte apropriados. 􀂃 Não manusear a amostra em trânsito. Não contaminar a superfície externa do frasco de coleta e verificar se ele está firmemente vedado. (caso ocorram respingos ou contaminação na parte externa do frasco, fazer descontaminação com álcool 70%)

6 Considerações de segurança
􀂃 Não contaminar a requisição médica que acompanha o material. 􀂃 As amostras deverão ser transportadas em sacos plásticos fechados. 􀂃 Identificar claramente a amostra coletada, com todos os dados necessários. 􀂃 Colocar a identificação no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rótulos. 􀂃 Encaminhar os materiais imediatamente ao laboratório.

7 TRANSPORTE DAS AMOSTRAS
Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao laboratório para: 􀂃 Assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo 􀂃 Evitar o contato prolongado dos microorganismos com anestésicos utilizados durante a coleta, pois eles poderão exercer atividade bactericida. 􀂃 Evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e lavado broncoalveolar. 􀂃 Consultar o laboratório para verificar a disponibilidade dos meios de transporte.

8 Amostras Inadequadas 􀂃 Material clínico recebido em solução de fixação (formalina). 􀂃 Ponta de cateter de Foley. 􀂃 Material conservado inadequadamente com relação a temperatura 􀂃 Frascos não estéreis. 􀂃 Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminação na superfície externa. 􀂃 Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida colhida no mesmo dia e da mesma origem. 􀂃 Swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos. 􀂃 Swab seco. 􀂃 Culturas para anaeróbios recebidas em condições não apropriadas.

9 MANUTENÇÃO DAS CULTURAS
PREPARO DE CULTURAS Uma vez obtida uma cultura satisfatória, a mesma deve ser mantida pura e viável e para isso é preciso: ـTransferir periodicamente a cultura em um meio de cultura adequado; ـ incubar até que a cultura atinja a fase estacionária máxima de crescimento; ـ e estocar em temperatura apropriada para impedir maior crescimento.

10 MANUTENÇÃO DAS CULTURAS
PUREZA DAS CULTURAS Para assegurar a pureza das culturas, estas devem ser obtidas periodicamente de uma cultura e verificadas regularmente quanto à pureza. Os métodos para avaliar a pureza da cultura variam com o tipo de cultura a ser testada. VIABILIDADE DA CULTURA A viabilidade é avaliada pela taxa de crescimento e atividade metabólica. A deterioração das culturas pode resultar do manuseio incorreto, do cultivo inadequado, de transferências freqüentes por um longo período, meio de cultura impróprio, mutação e ataque da bactéria por um bacteriófago.

11 MANUTENÇÃO DAS CULTURAS
ESTOQUE DE CULTURAS O estoque de culturas deve ser preparado de modo que as culturas sejam armazenadas e preservadas por um longo período sem transferência. Tais culturas tendem a permanecerem estáveis e são utilizadas como fonte de cultura caso a cultura ativa seja perdida e/ou deteriorada.

12 Surtos Colher material indicado pelo estudo epidemiológico
Não colher amostras cuja interpretação dos resultados não será esclarecedora para o surto Não confundir procedimentos clínicos e epidemiológicos com análise fiscal O exame microbiológico é um procedimento que envolve custos e deve ser um recurso utilizado com racionalidade Esclarecer o laboratório clínico quando se tratar de amostras de investigação de surto e quais as possíveis hipóteses

13 Surtos Colher amostras clínicas que visem o esclarecimento do diagnóstico: Confirmar a identificação da espécie ou da susceptibilidade do microrganismo com um laboratório de referência, se houver necessidade Ser criterioso na indicação de coletas de profissionais de saúde para não gerar problemas institucionais. Quando necessária a coleta, esclarecer o profissional suficientemente Ter clareza de qual será o procedimento a ser adotado em caso de resultado positivo, antes de iniciar a indicação da coleta (ex.: afastamento, tratamento,etc.) Manter a confidencialidade.

14 Surtos Colher amostras ambientais que possam ser correlacionadas com o diagnóstico estabelecido Ter em mente a hipótese de que se trata de surto propagado por pessoa-a-pessoa ou fonte única para saber indicar a coleta adequada . Ter em mente qual o possível agente e seus prováveis reservatórios e formas de transmissão (buscar na literatura) Não colher amostras ambientais se o laboratório clínico não dispuser de recursos técnicos para processá-la. Se necessário contatar um laboratório de referência.

15 Pseudo-surtos Mais freqüentemente associado a contaminação durante a execução do exame microbiológico. Eventualmente pode ser associado com contaminação sistemática de coletas Anti-sépticos contaminados Recipientes contaminados Profissional de saúde

16 Análise Fiscal Fonte:

17 Análise fiscal O processo de apreensão de amostra para análise fiscal de medicamentos só tem validade oficial se, tal ação, for desencadeada pela autoridade sanitária competente (vigilâncias sanitárias estaduais ou municipais), podendo ser desencadeada por denúncia, embora nem toda denúncia gere uma análise fiscal, ou indicado pelo Sistema de Monitorização de Medicamentos.

18 Análise Fiscal A análise fiscal consistirá na coleta de amostra representativa do estoque existente, a qual, dividida em três partes, será tornada inviolável, para que se assegurem as características de conservação e autenticidade. Uma parte é entregue ao detentor ou responsável, a fim de servir como contraprova, e as duas outras partes são imediatamente encaminhadas ao laboratório oficial do estado para realização das análises indispensáveis. São necessários materiais suficientes para três análises Tabela de número mínimo de itens para análise fiscal de medicamentos e produtos: ANVISA, FIOCRUZ FONTE: Informe SNVS/Anvisa/UFARM nº 1, de 7 de maio de 2004 [

19 Caracterização dos sistemas de tipagem
1. Tipabilidade: habilidade da técnica em produzir um resultado de tipagem para cada resultado 2. Reprodutibilidade: capacidade de gerar os os mesmos resultados quando uma mesma cepa for testada em repetidos ensaios laboratoriais. 3. Poder discriminatório: capacidade da técnica em diferenciar isolados não relacionados epidemiologicamente 4. Facilidade de realização 5. Facilidade de interpretação

20 Exemplos de tipagem molecular
Staphylococcus aureus, Unidade de Leito-Dia, HC-UNICAMP, 1998.

21 Exemplos de tipagem molecular
Staphylococcus aureus, Unidade de Pesquisa Clínica, UNICAMP, 2004.

22 Tipagem molecular A determinação de uma origem clonal para microrganismos isolados de diversas fontes (pacientes ou reservatórios) é uma etapa importante na identificação de surtos hospitalares. Informações quanto a origem clonal de isolados microbianos também permite melhor elucidar a cadeia epidemiológica e selecionar as medidas de controle mais objetivas.

23 Caracterização de clones
Métodos fenotípicos: Sorotipagem Perfil de susceptibilidade a antimicrobianos Susceptibilidade a bacteriófagos (fagotipagem) Apresentam algumas limitações de tipabilidade, poder discriminatório e reprodutibilidade Microrganismos de uma mesma origem clonal podem apresentar diferenças na manifestação fenotípica de alguns aspectos avaliados

24 Caracterização de clones
Métodos genotípicos: Baseado no polimorfismo encontrado no genoma Particularidades que podem ser acessadas por clivagem da fita genômica ou amplificação de um fragmento Resultado final: padrão de bandas específico para o clone, cuja aparência lembra um código de barras Interpretação envolve a comparação de padrões estabelecendo critérios de similaridade e diferenciação Maior tipabilidade, poder discriminatório e reprodutibilidade.

25 Métodos genotípicos Mais freqüentemente utilizados:
PCR = Polimerase Chain Reaction: baseado na amplificação de uma seqüência do DNA e análise do seu polimorfismo. Análise de plasmídeos: baseado na análise do DNA extra-cromossômico de bactérias PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis: baseado na análise de diferença entre os fragmentos produzidos pela clivagem do DNA com enzimas de restrição.

26 Métodos genotípicos A seleção dos métodos a serem utilizados depende de variáveis como: Tipo de microrganismo a ser estudado Tempo para execução do ensaio Disponibilidade dos recursos

27 Tipagem molecular A utilização de recursos de tipagem molecular não prescinde da necessidade de um esmerado estudo epidemiológico do fenômeno Nem todos os surtos requerem análises da origem clonal para seu esclarecimento A adequada identificação da espécie e correta realização do perfil de susceptibilidade a antimicrobianos e condição elementar para análise dos aspectos microbiológicos do surto.

28 Referências Bibliográficas:
LEVI, CE. Procedimentos Laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica. IN: ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde Manual de Coleta. FORTALEZA, CMCB. Aplicação dos sistemas de tipagem molecular à epidemiologia hospitalar de bactérias. Monografia apresentada para qualificação no Curso de Pós-Graduação em Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual de São Paulo - UNESP. MAIO, 1999. BRANCHINI, MLM. Aplicação de Métodos de Tipagem Molecular na Investigação de surtos intra-hospitalares. Tese de livre-docência apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP. PADOVEZE, MC. Estudo da Epidemiologia molecular dos Staphylococcus aureus Resistentes à Oxacilina em Pacientes Portadores de Síndrome de Imunodeficiência Adquirida. Tese apresentada ao Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de mestre.