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Disciplina: Introdução à Biotecnologia Estratégias Moleculares na Avaliação da Diversidade Microbiana em Amostras Ambientais Aluna: Catarina Macedo de.

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1 Disciplina: Introdução à Biotecnologia Estratégias Moleculares na Avaliação da Diversidade Microbiana em Amostras Ambientais Aluna: Catarina Macedo de Figueirêdo Orientadora: Margarida Matos de Mendonça

2 Milhões estima-se ser o número real de seres vivos; Milhões estima-se ser o número real de seres vivos; 1,5 Milhões de organismos vivos identificados. 1,5 Milhões de organismos vivos identificados. Diversidade Microbiana Bactérias 5 mil espécies 100 mil a 1 milhão de espécies Fungos 100 mil espécies 200 patogênicas aos seres vivos Protozoários 20 mil espécies poucas são patogênicas. (TORTORA, et al., 2005)

3 Ambientes da Diversidade Microbiana Ampla Microbiota Ampla Microbiota Solo Rizósféricos Solo Rizósféricos Águas Residuais Águas Residuais Sistemas de Lodo Ativado Sistemas de Lodo Ativado Baixa Microbiota Ar Ar Ambientes MarinhosAmbientes Marinhos Águas Doces Águas Doces Solo Solo

4 Avaliação da Diversidade Microbiana Diversidade Microbiana fracamente conhecida culturabilidade. CULTURABILIDADE CULTURA PURA TÉCNICAS MOLECULARES NOVAS TÉCNICAS DE CULTIVO

5 Estratégias de Detecção Técnicas - Detecção - Identificação - Quantificação Dependente de Cultivo Independente de Cultivo

6 Técnicas dependentes de cultivo Técnicas dependentes de cultivo Culturas Puras Culturas Puras Isolamento Cultivo Identificação Falha na detecção de microrganismos. Complexa formulação dos meios de cultura. Técnicas clássicas: bioquímica e microbiologia baixa determinação da biomassa e da estrutura. Falsa representação da diversidade microbiana em amostras ambientais. Tempo. (HURST, et al., 1997)

7 Técnicas independentes de cultivo Técnicas independentes de cultivo Descrição da diversidade microbiana; Definição da estrutura e dinâmica de comunidades complexas; Técnicas moleculares; Desenvolvimento de novos métodos moleculares de identificação de microrganismos não cultiváveis. (WALNER, et al., 1997; LEE, et al., 1999; NILSEN, et al., 1999; FOSTER, et al., 2003)

8 Águas Residuais Esgoto: Esgoto: Líquido caracterizado pelos despejos provenientes das diversas modalidades de uso e de origem das águas, tais como as de uso doméstico, comercial, industrial, utilidade pública, de áreas agrícolas, de superfície, de infiltrações, pluviais e de outros efluentes sanitários. (JORDÃO & PESSOA, 1995)

9 Esgotos Domésticos – Despejos domésticos, pluviais, infiltrações e pequenas parcelas industriais Industriais – provêm de qualquer utilização da água para fins industriais. Características do Esgoto - Físicas Matéria sólida Odor Cor e turbidez (JORDÃO & PESSOA, 1995)

10 - Químicas Matéria Orgânica: proteínas, carboidratos, gorduras e óleos, uréia, surfactantes, fenóis, pesticidas Matéria inorgânica: areia, substâncias minerais dissolvidas. - Microbiológicas Bactérias Fungos Vírus Algas Protozoários (JORDÃO & PESSOA, 1995)

11 Tratamento de Esgoto Objetivo: Separar a água dos componentes sólidos, com a intenção de purificar a água, tornando-a livre de patógenos e poluentes, podendo ser liberada ao meio ambiente. (HURST, et al., 1997) Etapas: Processo físico Processo químico Processo biológico (JORDÃO & PESSOA, 1995)

12 Tratamento de Esgoto Tratamento Primário Tratamento Secundário Tratamento Terciário Processo Químico Processo Biológico Processo Físico

13 Tratamento de Esgoto Processo biológico Oxidação do lodo (aeróbia) Digestão do lodo (anaeróbia) Lodo ativado É uma fase essencialmente biológica no sistema de tratamento de esgoto doméstico e industrial, realizada aerobicamente. O lodo ativado é composto por materiais sedimentados provenientes das seqüências de águas residuais e de sólidos gerados pelo processo de tratamento de esgoto (DAVIS & CORNWELL, 1998)

14 Lodo Ativado MicrorganismosMicrorganismos Forma livre Agregada - flocos Aeração Aeração - Agitação - Suplemento de O 2 - Dispersão microbiana Sedimentação Sedimentação - Biomassa floculada -Sólidos retornam ao compartimento aeróbico

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19 Lodo Ativado Compostos orgânicos [ O 2 ] Compostos inorgânicos Multiplicação Crescimento celular Produção de energia Produção de CO 2, NO 3, O 2, SO 4, PO 4, H 2 O.

20 Lodo Ativado Características Físico-Químicas: Matéria orgânica, nutrientes, metais pesados, compostos inorgânicos potencialmente tóxicos. Finalização inadequada do tratamento: Riscos à saúde, acúmulo de metais pesados ou compostos orgânicos no solo ou no efluente. Microbiologia do Lodo Ativado (GONÇALVES, et al., 1999) - Diversidade microbiana - Dinâmica das populações - Predomínio bacteriano (GRAY, 1990)

21 Lodo Ativado Bactérias Dispersas na fase líquida Associadas ao floco e participando de sua estrutura Associadas ao floco, mas não participando da sua formação Bactérias do afluente bactérias do lodo Fatores - pH - Temperatura - O 2 - Nutrientes - Agitação - Carga afluente - Idade. (HURST, et al., 1999; GRAY, 1990)

22 Lodo Ativado AcinetobacterHyphomicrobium AlcaligenesMicrobacterium BacillusPseudomonas BrevibacillusSphaerotilus CanlobacterDebaromyces ComomonasFlavobacterium Cytophaga Gêneros envolvidos no consumo da matéria orgânica (GRAY, 1990)

23 Lodo Ativado Nitrificantes Desnitrificantes Uréia NH 4 NO 3 NO 3 N 2 Nitrosomonas Pseudomonas Nitrospira Denitrobacillus Nitrocystis Spirillum Nitroglea Micrococcus Nitrobacter Xanthomonas Nitrococcus Nitrospina (GRAY, 1990)

24 Fungos Pequena incidência; Estão associados à estrutura do floco Associado a Idade pH < 6,0 dominância fúngica Protozoários Componente comum; Gêneros resistentes Giardia e Cryptosporidium Lodo Ativado

25 Vírus Organismos aquáticos ou patógenos ao homem. Grupos Presentes: Enterovirus Orthoreovirus Rotavirus Mastaadenovirus Bacteriófagos material fecal Doenças entéricas

26 Técnicas Moleculares Utilizadas na Identificação Microbiana no Lodo Ativado Métodos Tradicionais Isolamento; Identificação: morfologia e bioquímica. (LIU, et al., 2005) Métodos Moleculares: Estudo das sequências de rRNA. Identificação da microbiota Técnica independente de cultivo Determinação da diversidade (DAHLLOF, 2002)

27 CULTURA FISH AMOSTRAS PCR in situ EXTRAÇÃO PCR SEQÜÊNCIAMENTO CLONAGEM DGGE, TGGE MICROARRANJOS HIBRIDIZAÇÃO (DAHLLOF, 2002)

28 Hibridização in situ e FISH Metodologia Hibridização de uma seqüência alvo de DNA ou de RNA com uma sonda de oligonucleotídeos marcada quimicamente ou radioativamente. Sondas Específicas Identificação dos microrganismos. FISH Técnica Molecular Independente de cultivo Possibilidade de identificação da diversidade microbiana, sem alteração da sua estrutura espacial. (COOPER, 2002; ALBERTS, et al., 2006)

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31 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado Inúmeros trabalhos relatam a utilização da técnica de FISH na avaliação da diversidade microbiana nos sistemas de Lodo Ativado.

32 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado Chen et al., 2003 Análise de seqüências específicas de 16S rRNA Estudo as alterações na prevalência de organismos de acordo com a concentração de cloro: Concentração de Cl mg/L Oxidantes de NH 4 Predominância de Nitrossomonas Oxidantes de NO 2 Nitrobacter Redução do floco da [ Cl-] Até 10 mg/L mesma predominância 10 mg/L diferentes espécies de Nitrossomonas Nitrobacter Predominância contínua.

33 Fonte: CHEN, et al., 2003

34 Fonte: Chen et al., 2003

35 Liu et al., 2005 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado Análise de seqüências específicas das subunidades 16S do rRNA. Estudo para identificação das EBPR (bactérias removedoras de P). Análise do PPs intracelulares (PAOs) DAPI Sondas: EUB 338, GAM 42ª, ACA 23 Protebacteria Prevalência de 70 % -Proteobacteria 60 % Gênero Acinetobacter 31 % Não caracterizada como PAO (organismo acumulador de polifosfatos) PAOs não foram caracterizados sequênciamento pequena similaridade com Banco de Genes.

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37 Wong et al., 2005 FISH na avaliação da diversidade microbiana no Lodo Ativado Hibridização de seqüências – alvo de rRNA com sondas fluorescência (FISH) Estudo para identificação de EBPRs PAOs, GBs Sondas: EUB mix, PAO mix, actino_1011 EUB mix 9 % de PAOs Rhodocyclus β- Proteobacteria predominância dentre as PAOs 10-30% das Eubacteria Tretrasphera Actinobacteria actino_ %; β- Proteobacteria apresentaram-se predominantes com 25% 30-60% da população EBPRs

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39 Conclusões Vantagens da Utilização da Técnica de FISH: FISH possibilita a avaliação da diversidade microbiana sem a necessidade de cultivo; Possibilita a quantificação e determinação da estrutura da comunidade microbiana; Permite a detecção das alterações da prevalência microbiana nas comunidades estudadas; Diversas metodologias que podem ser específicas às células a serem hibridizadas; Técnicas de metodologias relativamente rápidas e de fácil execução, em relação às técnicas dependentes de cultivo.

40 Desvantagens da utilização da Técnica de FISH: Identificação de microrganismos específicos; Na determinação da microbiota de uma comunidade utilização de muitas sondas diferentes; Custo relativamente alto; Sobreposição das sondas hibridizadas Alteração das cores emitidas pelas sondas dificuldade na identificação do microrganismo; Metodologias dependentes da permeabilidade dos microrganismos em relação a entrada das sondas.


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