Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com cacaueiro Alinne Batista Ambrosio Orientador: Prof. Dr.

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1 Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com cacaueiro Alinne Batista Ambrosio Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Co-orientadora: Dra. Odalys García

2 INTRODUÇÃO Vassoura-de-bruxa AIME AND PHILLIPS-MORA, 2005.

3 Sintomas - Hipertrofia - Hiperplasia - Superbrotamento - Frutos partenocárpicos Introdução  Desbalanço hormonal.

4 DHPatógeno Hospedeiro Doença Introdução Desbalanço hormonal

5 Hipótese de trabalho M. perniciosa na fase biotrófica é capaz de sintetizar giberelina que deve produzir um desbalanço hormonal no cacaueiro criando as condições favoráveis para o estabelecimento do fungo e o desenvolvimento da doença.

6 OBJETIVOS 1.Avaliar a identidade e expressão de genes do fungo relacionados à síntese da giberelina. 2. Avaliação da possível produção de giberelina pelo fungo. 3. Análise funcional dos genes por complementação de mutantes de G. fujikuroi

7 1.Avaliar a identidade e expressão de genes do fungo relacionados à síntese da giberelina. OBJETIVO 1 Identidade dos genes por sequenciamento Teste de atividade Análise filogenética Análise do número de cópias de cada gene Análise de expressão gênica por real time-PCR

8 Metodologias e Resultados 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 CPS-KSGA4-desGGPP 1. Hind III 2. DNA genômico 3. ALU I 4. BamHI 5. EcoRI 6. EcoRV 7. HindIII 8. HinfI 9. KpnI 10. SacI 11. SfiI 12. Nde 13. NotI 14. Sonda CPS-KS 15.Sonda GGPP 16.Sonda GA4-des Análise do número de genes por Southern Blot Cópia única

9 Análise de identidade Sanger; RACE; Biblioteca de fagos; 454; Solexa.

10 CPS-KS (tBlastn a partir da seqüência de G. fujikuroi) Metodologias e Resultados Análise de seqüência do gene CPS-KS a partir dos dados de pirosequenciamento CPS-KS de M. perniciosa teria 567 aa.

11 tBlastn ent-copalyl diphosphate synthase A. thaliana (NP192187) X M.perniciosa Metodologias e Resultados Análise de Blast CPS de plantas vs genoma de M. perniciosa

12 tBlastn ent-kaurene synthase de planta (Q9SAK2) Metodologias e Resultados Análise de Blast KS de plantas vs genoma de M. perniciosa

13 Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS Metodologias e Resultados Análise de identidade Biblioteca de M. perniciosa em fagos Infectar células E. coli Obtenção de placas de lise Transferência de placas de lise para membrana Hibridação com sondas específicas CPS-KS

14 Metodologias e Resultados 1. Hind III 2.Controle negativo do PCR 3.GA4 (L4) 4.GA4 (L6) 5.Controle negativo 6.CPS-KS(L4) 7.CPS-KS(L6) C L 4 L 6 C L 4 L 6 Amplificação por PCR dos genes a partir do DNA de fagos GA4dCPS-KS Os genes da via de síntese de GA em M. perniciosa estão em cluster?

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16 Análise Filogenética de CPS-KS Genomas de Basidiomicetos: - Lacaria bicolor, - Phanerochaete chrysosporium, - Ustilago maydis, - Criptococus neoformans, - Coprinus cinereus. Moniliophthora: único basidiomiceto sequenciado que apresenta CPS-KS

17 Análise de expressão por Real time-PCR

18 Resultados preliminares. Experimentos de Southern Blot confirmaram a existência de uma única cópia de cada gene, como já era esperado pela a análise das seqüências do genoma.. Aparentemente o gene CPS-KS de M. perniciosa tem os dois domínios condensados em uma proteína menor do que as descritas para outros fungos.. Os genes GA4-desaturase e o CPS-KS em M. perniciosa possivelmente estão em regiões próximas do mesmo cromossomo. Metodologias e Resultados

19 2. Avaliação da possível produção de giberelina pelo fungo. OBJETIVO 2 - Identificação de giberelina em sobrenadante de cultura do fungo mediante acoplamento das técnicas de cromatografia em camada fina (TLC) com espectrometria de massas (Laboratório Thomsom- IQ-UNICAMP).

20 Estratégia seguida para a avaliação da possível produção de giberelina pelo fungo Fungo necrotrófico/biotrófico/ Meio biotrofico Liofilização Cromatografia em camada fina (TLC) Espectrometria de massa Extração de RNA PCR tempo real Extrato de Esporos Metodologias e Resultados

21 A.B.C.

22 Resultados preliminares Os resultados da espectrometria sugerem a presença de giberelina em amostras do fungo na fase biotrófica, indicando que o fungo pode ter a capacidade de produzir esse hormônio. Metodologias e Resultados

23 ABA1 ABA2 GA3_2 GA3_1 Paclo1 Paclo2 Paclo Infc.1 Paclo infc.2 GA3 infc.1 ABA infc.1ABA infc.2 GA3 infc.2

24 ABA ABA/GA3

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26 Plano de trabalho Avaliação da indução de sintomas em plântulas de cacau por GA3 através da aplicação do hormônio e inibidor em plântulas sadia e infectadas - Quantificação de GA, - Análise de microscopia, - Análise de expressão gênica de CPS-KS e receptores da planta.

27 SadiaInfectada Controle Controle (etanol) GA 3 Paclo Paclo + GA3 GA3 + Paclo Paclo + I + GA3 GA3 + I + Paclo I + Paclo + GA3 I + GA3 + Paclo

28 Avaliação da produção de GA pelo fungo - Teste de atividade da proteína CPS-KS, - Bioensaios com arroz e isolamento do hormônio em culturas, - Teste de complementação. Avaliação da indução de XETs e invertases em cultura de células de cacau por GA3 - Análise de expressão, - Análises bioquímicas (balanço amido – sacarose).

29 123456789101112 Plant. tratamentosxxxxxx Teste de expressãoxxxxxxxx Microscopiaxxxxxxxxx Quantificação GA (plântulas) xxxxxxx Quantificação GA (culturas) xxxxxxx Bioensaioxxxx Isolamento do genexxxxx Teste de atividadexxxxxx Complementaçãoxxxxx XETs e invertasesxxxxxxx