Antimicrobial potential of metabolites extracted from bacterial symbionts associated with marine sponges in coastal area of Gulf of Mannar Biosphere, India Mestrado em Biologia Celular e Molecular 2014/2015 Laboratório em Microbiologia Professoras: Isabel Amorim; Olga Lage Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues S. Skariyachan, A. G. Rao, M.R. Patil, B. Saikia, V. Bharadwaj KN and J. Rao GS

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Introdução As esponjas marinhas albergam diversos microrganismos – até 40% do conteúdo celular total Endossimbiose entre microrganismos e os seus hospedeiros– digestão, nutrição, estabilização do esqueleto e defesa química.

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Introdução As esponjas marinhas são uma fonte muito rica de metabolitos secundários bioactivos. Os metabolitos isolados das esponjas pertencem a uma miríade de classes de compostos: alcalóides, poliéteres, terpenóides, péptidos, etc.

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Introdução As regiões costeiras da Índia têm uma ampla diversidade em esponjas marinhas Golfo de Mannar, Tamil Nadu, Índia Gulf of Mannar Biosphere Procura de metabolitos bioactivos em esponjas desta região

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Captura das Esponjas Captura com redes de pesca de caranguejo Sacos herméticos com água do mar; 4ºC Processamento das amostras 12h

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Captura das Esponjas Seis esponjas marinhas distintas Cacaspongia spp. Sigmadocia spp. Callyspongia spp. Dendrila spp. Haliclona spp. Gorgonid spp.

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Isolamento dos microrganismos Lavagem das esponjas e homogeneização das amostras Diluição dos homogeneizados e inoculação em marine agar Contagem do número de CFU por grama de amostra 24 horas

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Isolamento dos microrganismos Isolamento seletivo das bactérias MacConkey agar TCBS agar BTB lactose agar Milk agar com cetrimida A maioria das bactérias eram bacilos ou cocos Gram-positivos Callyspongia spp. apresentava Pseudomonas spp. Vibrio spp. encontrava-se presente em todas as amostra Staphylococcus spp. presente em todas as amostras

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Teste preliminar de Bioactividade Teste da bioactividade dos isolados por agar overlay method MRSA Proteus mirabilis Klebsiella organismis Salmonella typhi Dois isolados com bioactividade Callyspongia spp. – MRSA Haliclona spp. – Salm. typhi

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Análise bacteriológica das estirpes Testes bioquímicos Indole Vermelho de metilo Vogues Prauskauer Citrato Triple sugar iron Hidrólise do amido Nitratos Urease Catalase Oxidase H2SH2S Os metabolitos bioactivos são de natureza extracelular

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Isolamento e purificação dos metabolitos Crescimento dos isolados em marine broth e em minimal essential media (agitação, a 35 º C) Centrifugação das culturas a x g 7 dias 20 min Recolha do sobrenadante Recolha da fase orgânica (armazenamento a 4 º C) Separação líquido-líquido com acetato de etilo

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Teste de Bioactividade Teste de bioactividade dos extratos por método de difusão por poços (25 a 100 µM) MRSA Salmonella typhi Extratos com actividade antimicrobiana Callyspongia spp. – MRSA Haliclona spp. – Salm. typhi Callyspongia spp. – Pseudomonas spp. Haliclona spp. – Bacillus spp.

Meyer, Wagner – alcalóides Molisch – carbohidratos Libermann Burchard – esteróides Ácido sulfúrico – quinonas Cloreto de ferro (III) - fenóis Biureto, Ninidrina, Bradford - proteínas Testes para lípidos, flavanóides e flavonil glicósidos Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Análise fitoquímica polytheonamide B plakorsin A Pseudomonas spp.Bacillus spp. Alcalóides Quinonas Flavonil glicósidos FlavanóidesCarbohidratos -Proteínas -Lípidos

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Purificação e caracterização dos metabolitos Cromatografia em camada fina (acetato de etilo - hexano, 30:70) Cromóforo – Pseudomonas spp. Fluoróforos – Bacillus spp. Eluição dos compostos para análise por espetrofotometria UV-Vis

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Purificação e caracterização dos metabolitos Espetrofometria UV-Vis Cromóforo – pico aos 600 nm Fluoróforos – picos aos 280 e aos 320 nm -OH, -CN, -CH e –CO Espectroscopia FT-IR do cromóforo O composto cromóforo é mais eficiente na inibição do crescimento das estirpes de teste

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Caracterização molecular das bactérias Análise genómica – sequenciação genes rRNA 16S Primers universais: 16F - 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 16R - 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ Sequenciação dos amplificados: Cromóforo - Pseudomonas spp. RHLB12 (99% ID) Fluoróforo - Bacillus licheniformis T6-1 (96% ID) KF (GenBank)

MRSA Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Em suma… Haliclona spp. Bacillus licheniformis T6-1 Salm. typhi Callyspongia spp. Pseudomonas spp. RHLB12 Identificação de dois compostos com potencial farmacológico contra bactérias patogénicas

Mestrado em Biologia Celular e Molecular (2014) - João Manuel Silva Rodrigues Críticas ao artigo Discussão dos resultados muito confusa Falta de coerência na citação das imagens ao longo do artigo Análise química e estrutural muito pobre Caracterização molecular – programa de PCR Poderiam ter feito análise para genes que codificam NRPS, para avaliar qual a natureza dos metabolitos bioactivos Falta de uma conclusão (Fase muito inicial do estudo?)