T/NK-cell Progenitor Thymus T-cell Progenitor NK-cell Progenitor HEMATOPOIESE Stem cell CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-MCFU-G B-cell Progenitor CMP CFU-GEMM CLP LINFÓCITOS MADURO c. visível ERITRGRANMONOPLT IMATURO Compartimento invisível BLASTO

Esfregaço de MEDULA OSSEA

LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA CITOGENÉTICA Observação de 1 a 100 células FISH Observação de 1 a 100 células CITOMETRIA DE FLUXO células/min CAPACIDADE DE ANÁLISE - PATOLOGIA

DEFENIÇÕES Citometria de Fluxo - Flow Cytometry –Mede as propriedades das células em suspensão Células em suspensão fluem em “fila-única” através dum espaço confinado onde estas são exposta a um feixe de luz e emitem fluorescência. Esta é colectada, filtrada e convertida em valores digitalizados que são guardados num computador.Líquido Optica Electronica Flow Sorting –Separa as células (Sorting) baseando-se nas suas propriedades –Também designado Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

1° laser – 15mW 488nm air-cooled argon-ion laser 2° laser – 635nm red diode laser Becton Dickinson FACSCalibur Becton Dickinson FACSCalibur 4-color analyser...Equipado com 2 lasers...e 4 detectores de fluorescência FL1 – 530 ± 15nm FL2 – 585 ± 21nm FL3 – 670+nm FL4 – 661 ± 8nm

Forward light scatter Side light scatter Lixo Fluxo Laminar: o líquido da amostra passa pelo tubo central e não se mistura com solução tampão CITOMETRO - ESQUEMA Laser Feixe laser Nozzle ( µm) Amostra em suspensão Regulador de amostra Sheath fluid Bomba de ar Regulação da pressão de ar

Emissão detectada a 180ºC (frente) em relação ao eixo do laser Emissão detectada a 90ºC (lateral) em relação ao eixo do laser Forma e homogeniedade da célula FSC Laser ssc Tamanho da célula (ou particula) FSC Laser

Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro? Granulócitos Monócitos Linfócitos FSC SSC 90 Degree Scatter Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection Scale Purdue University Cytometry Laboratories

T/NK-cell Progenitor Thymus T-cell Progenitor NK-cell Progenitor LINFÓCITOS B-cell Progenitor IMATURO Compartimento invisível Stem cell CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-MCFU-G CMP CFU- GEMM CLP BLASTO Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro?

CD45 CD34 CD38 Fresh CB CD34+ cells 96.5% 98% CD34 + CD38 + Progenitores hematopoiéticos Stem cell CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-MCFU-G CMP CFU- GEMM CLP CD10 CD % DIFERENCIAÇÃO CELULAR Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro? CD45 CD34 Diferenciação de células B FluorochromeEmission FITC525nm PE575nm PE-TexasRed613nm GFP515nm Propidium Iodide600nm

Análise DNA CICLO CELULAR PI Fluorescence DNA content G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G2G2G2G2M CountCount 2N 4N

Ciclo celular – Detecção de Fase S J.W. Gray, F. Dolbeare & M.G. Pallavicini - MLM Chapt. 23 Incorporação de um nucleótido marcado - Bromodeoxiuridina (BrdU) (análogo da timidina) BrdU PI

ALTERAÇÕES FUNCIONAIS/BIOQUIMICAS  Aumento dos niveis livres de cálcio  Interações bcl2/BAX  Desidratação celular  Perda dos potênciais de membrana mitocôndriais  Proteolise  Externalização fosfatidilserina  Proteolise Lamin B  Desnaturação DNA  Clivagem kb  Clivagem intranucleosomal  cross-linking de proteínas ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS  Célula “encolhe”  A forma da célula muda  Condensação do citoplasma  Alterações no envelope nuclear  Fagmentação nuclear  Perda de estruturas de superfície  Corpos apoptóticos  Descolamento celular  Fagocitose dos “debris” celulares APOPTOSE – Morte celular programada

DETECÇÃO de Sub G1 Células apoptóticas começam a ter menos DNA que células normais em G1 PI Fluorescence N 4N Indução de morte celular com adição de substância tóxica Quantificação de DNA

Residuos de Fosfatidilserina (PS) são translocados para a face externa: Sinal para as células vizinhas iniciarem a fagocitose Detecção das fases iniciais de apoptose

As células podem ser separadas até 25,000 células/segundo em ambiente esterelizado (importante para estudos in vitro ou in vivo das células separadas) 488 nm laser + - Fluorescence Activated Cell Sorting Placas carregadas Células separadas e recolhidas uma a uma FSC Fluorescence detector Adaptado de Purdue University Cytometry Laboratories