Ação do hormônio tireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do fator de necrose tumoral alfa Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin Amato

Eixo hipotálamo-hipófise-tireoide T4 + T3 Circulação Tecidos Tecidos

Efeitos fisiológicos do hormônio tireoidiano Desenvolvimento Homeostase Proliferação e diferenciação celular Sistema Nervoso Central Função reprodutiva SNC SNC A IMPORTÂNCIA DOS HORMÔNIOS tireoideanos (HTs) no desenvolvimento, homeostase, proliferação e diferenciação celular tem sido bem documentada. Sabe-se que, nos mamíferos, os HTs atuam em todos os órgãos e vias metabólicas e seus principais efeitos incluem o desenvolvimento de vários tecidos, como o do sistema nervoso central, consumo de oxigênio, regulação da temperatura corporal, freqüência cardíaca e também o metabolismo de carboidratos, proteínas e gorduras. Além disso, participam da síntese e a degradação de muitos outros fatores de crescimento e hormônios, o que resulta em outros efeitos secundários (1,2). Consumo de oxigênio Frequência cardíaca Temperatura corporal Atividade de outros hormônios Metabolismo de nutrientes

Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano Histonas desacetiladas + T3 Na ausência do hormônio a ligação de correpressores ocorrendo um silenciamento da transcrição. Na presença do hormônio a uma mudança conformacional do receptor que resulta em desligamento dos correpressores e recrutamento dos co-ativadores e da maquinaria transcrição basal com a transcrição dos genes alvo. Transcrição Histonas acetiladas

Deficiência x excesso de hormônio tireoidiano HIPOTIREOIDISMO Bradicardia Pele ressecada e fria Hipoglicemia Hipercolesterolemia Redução da taxa metabólica basal HIPERTIREOIDISMO Taquicardia Pele quente e úmida Hiperglicemia Hipocolesterolemia Aumento da taxa metabólica basal Excesso e falta da ação do hormônio tireoidiano: modelos que permitem entender efeitos do hormônio e sua importância

Hipotireoidismo x doença cardiovascular Hipotireoidismo franco e aparelho cardiovascular  frequência e contratilidade cardíaca  expressão de genes que codificam enzimas que regulam contratilidade e relaxamento cardíaco Thyroid hormone and the cardiovascular system: from theory to practice. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78:1026. Biochemical basis of thyroid hormone action in the heart. Am J Med 1990; 88:626.

Hipotireoidismo x doença cardiovascular Hipotireoidismo subclínico e aparelho cardiovascular  incidência de doença aterosclerótica  mortalidade cardiovascular Subclinical hypothyroidism is an independent risk factor for atherosclerosis and myocardial infarction in elderly women: the Rotterdam Study. Ann Intern Med 2000: 132:270. Risk for ischemic heart disease and all-cause mortality in subclinical hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3365. Subclinical hypothyrodism is associated with a low-grade inflammation, increased triglyceride levels and predicts cardiovascular disease in males below 50 years. Clin Endocrinol (Oxf) 2004; 61:232. Impaired endothelium-dependent vasodilation in subclinical hypothyroidism: beneficial effect of levothyroxine therapy. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:3731

Por que o hipotireoidismo aumenta o risco de doença cardiovascular?  resistência vascular periférica  piora de hipertensão arterial sistêmica Hipercolesterolemia Hiperhomocisteinemia Será que o hormônio tireoidiano com a ação do seu receptor influenciaria no processo inflamatório? Essa poderia ser a explicação da deficiência de hormônios tireoidianos e doença cardiovascular? Doença cardiovascular aterosclerótica x inflamação sistêmica O hormônio tireoidiano e seu receptor poderiam influenciar o processo inflamatório?

Há outras condições que compartilham alterações do eixo HHT e alterações inflamatórias?

Síndrome do T3 baixo Função tireoidiana em doenças não tireoidianas TSH normal ou baixo Correlação  T3 e marcadores inflamatórios Association between serum interleukin-6 and serum 3,5,3’-triiodothyronine in nonthyroidal illness. J Clin Endocrinol Metab 1993;77(6):1695–9. Relationship of the increased serum interleukin-6 concentration to changes of thyroid function in nonthyroidal illness. J Endocrinol Invest 1994;17:269–74. Role of cytokines in the pathogenesis of the euthyroid sick syndrome. Eur J Endocrinol 1998; 138:603–14. Relating circulating thyroid hormone concentrations to serum interleukins-6 and -10 in association with non-thyroidal illnesses including chronic renal insufficiency. BMC Endocr Disord 2008;8:1.

Insuficiência cardíaca Correlação negativa T3 x IL-6, TNF- e proteína C reativa P < 0,05, r = -0,14 Controle T3L > 2 T3L < 2 T3L (pg/mL) TNFa (pg/mL) Relationship between triiodothyronine and proinflammatory cytokines in chronic heart failure. Biomedicine & Pharmacotherapy 2010; 64:165-169.

Doença renal crônica Função tireoidiana na doença renal crônica  T3 TSH normal, T3 reverso normal Correlação  T3 x marcadores inflamatórios (IL-6, TFN-alfa)e sobrevida Clinical and biochemical implications of low thyroid hormone levels (total and free forms) in euthyroid patients with chronic kidney disease. J Intern Med 2007; 262:690–701. Low triiodothyronine: a new facet of inflammation in end-stage renal disease. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2789–2795. Low triiodothyronine and survival in end-stage renal disease. Kidney Int 2006; 70:523–528. Subclinical hypothyroidism is linked to micro-inflammation and predicts death in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transplant 2007; 22:538–544.

Hormônio tireoidiano x inflamação Relação causa – efeito? Direcionalidade?

Receptores Nucleares O que são? Uma superfamília  48 genes  75 proteínas São complexos de sinalização que atuam de várias maneiras, modulando a ativação e a repressão de sinais.

Domínio carboxi - terminal Domínio amino - terminal Dobradiça (Hinge) Domínio carboxi - terminal Domínio amino - terminal A/B C D E F AF - 1 DBD LBD Ligação ao DNA Ligante Transativação Ligação ao ligante

Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano Histonas desacetiladas + T3 Na ausência do hormônio a ligação de correpressores ocorrendo um silenciamento da transcrição. Na presença do hormônio a uma mudança conformacional do receptor que resulta em desligamento dos correpressores e recrutamento dos co-ativadores e da maquinaria transcrição basal com a transcrição dos genes alvo. Transcrição Histonas acetiladas

Macrófagos e monócitos Modelo de estudo Fator de necrose tumoral alfa (TNF-) Inflamação sistêmica Macrófagos e monócitos Indução de apoptose e inibição de tumorigênese Receptor de membrana Adipócitos, células mesangiais Inibição da replicação viral Tumor necrosis factor Fator de necrose tumoral alfa é uma citocina envolvida na inflamação sistêmica e é membro de um grupo de citocinas que estimula a reação de fase aguda. São produzidas em macrófagos e monócitos e/ou adipócitos e células mesangiais e atuam em receptores de membrana. Sua função é na regulação das células imunes capazes de induzir a inflamação sistêmica, induzirem morte celular por apoptose, inibir também a tumorigênese e inibição da replicação viral. Isso está relacionado às doenças humanas como resistência insulínica, síndrome metabólica e doença cardiovascular aterosclerótica. Dysregulation and, in particular, overproduction of TNF have been implicated in a variety of human diseases, as well as cancer.[1] Recombinant TNF is used as an immunostimulant under the INN tasonermin. Doenças humanas Resistência insulínica, síndrome metabólica, doença cardiovascular aterosclerótica

Objetivo Objetivo Geral: Objetivos Específicos: Estudar o efeito do T3 e de seu receptor sobre a atividade transcricional no promotor do gene do TNF-α e esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na regulação desse gene. Objetivos Específicos: Estudar o efeito do T3 na regulação da atividade transcricional do receptor do hormônio tireoidiano no promotor do gene do TNFα. Estudar o efeito das diferentes isoformas de TR (TRα e TRβ). Avaliar a importância da interação direta de TR com o promotor do TNFα. Avaliar o efeito do T3 na síntese de proteína TNFα.

Construções de plasmídeos repórteres contendo promotor do TNF (inteiro ou fragmentos) -125 LUC -82 TNF RE -1044 (-125/-82) 3X +93 TK Esse é um plasmídeo utilizado pelo Tiago, onde a um promotor completo e fragmentos.

TR e (-1044) TNF-Luc Células U937 b a c - + Taxa de ativação LUC Receptor 1 mcg + (-1044)TNF-Luc 4 mcg 25 50 75 100 125 150 175 vetor vazio TR alfa TR beta LBDTR beta T3 100 mM + - a b c Taxa de ativação Células U937 LUC -1044 +93

Transfecção O que é? Introdução de moléculas exógenas em células DNA plasmidial Em geral, a transfecção é seguida pela expressão de um ou mais genes presentes no DNA introduzido Ensaio de gene repórter Métodos Precipitação do fosfato de cálcio Lipossomos Eletroporação

Ensaio Gene Repórter Pra que serve o ensaio? Para estudar a expressão dos genes Avaliando o efeito de uma seqüência regulatória de um determinado gene O que podemos realizar com o ensaio? Delimitar os elementos regulatórios Avaliar os efeitos de agentes hormonais Estudar impactos em mutações gênicas

Procedimento Processos: Lavagem (PBS 1x); Tripsina (0,5%); DMEN inibir a Tripsina Centrifugar: 5 min a 2000 rpm.

Procedimento Pellet: células Sobrenadante: meio de cultura Suspensão das células em solução tampão (PBS, cálcio, glicose)

+ 500 L suspensão de células Mistura da suspensão de células ao DNA plasmidial Transferência da suspensão de células + DNA plasmidial para cuvetas de 0,4 cm Eletroporação DNA plasmidial TR TRE-luciferase + 500 L suspensão de células (10 x 106 células) 500 L /cuveta (10 x 106 células) 950 F e 0,3 kV

Ressuspensão das células eletroporadas em meio de cultura Distribuição da suspensão de células em placas de 12 poços e tratamentos 1 mL/poço Veículo T3 10-5M T3 10-6M T3 10-7M

Avaliação da expressão do gene repórter 37oC e 5% CO2 24h Luminômetro As células transfectadas e tratadas são incubadas durante 24h a 37 graus e em ambiente com 5% de CO2, e depois desse período de tempo são recoletadas, o conteúdo de cada poço é colocado em um tubo de 1,5 mL. Esses tubos são centrifugados para separar as células do meio de cultura, o meio de cultura é desprezado, e as células são lisadas pela adição de um tampão de lise. A lise celular permite que toda a luciferase que tenha sido produzida pelas células seja exposta para avaliação de sua atividae. Para avaliar a atividade da enzima, são misturados 20 mcL do lisado de células e 20 mcL do substrato da luciferase. O que se espera com isso? 10 μL do lisado celular + 10 μL do substrato da enzima luciferase

Células U-937 LUC -1044 +93

Células U-937 LUC -1044 +93

Células U-937 -125 LUC -82 TNF RE -1044 (-125/-82) 3X +93 TK

Células U-937 -125 LUC -82 TNF RE -1044 (-125/-82) 3X +93 TK

O TR interage diretamente com o promotor do TNF-? Ensaio de anisotropia de fluorescência wtTNFRE (CACTACCGCTTCCTCCAGATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCAAG) + Para minha surpresa DBD se ligou melhor a sequencia mutada. Alem disto, o DBD tem uma leve tendencia para se ligar como dimero, Hill Coef maior que 1, e se liga claramente como monomero na sequencia mutada.  Bom, achei muito interessante, pois se o DBD se liga aquela sequencia degenerada que vcs apontaram, que fica 1 bp upstream do nTRE (GGGTTT), este sitio poderia ser responsavel pela ligacao do DBD na forma dimerica.  Do ponto de vista biofisico e talvez biologico, isto seria muito legal investigar com mais detalhes, digo, estamos vendo um  dimero onde um monomero se liga maior afinidade que o outro.  Mas isto tudo eh especulacao, pois temos mutar o outro sitio degenerado, e tb uma dupla mutacao dos dois sitios... Vou tentar fazer isto em breve... DBD-TR

Próximos passos… Ensaios de gene repórter com mutantes do TRb L422R (Mutante do TR beta – Leucina 422 trocada por uma Arginina) – diminuição da capacidade de dimerização Ensaios de gene repórter com mutantes do TRb Papel da dimerização na repressão do promotor do TNFa: L422R Papel da superfície de interação com correpressores na repressão do promotor do TNFa: G345R e F451X. Avaliação da expressão do TNFa em resposta ao tratamento com T3 Cultura de células: células mesangiais humanas Interação TR e promotor do TNFa in vitro (gel shift) G345R (Mutante no domínio de Ligação ao Ligante – LBD – Glicina 355 trocada por uma Arginina) – perda da afinidade do TR ao T3, não afetando ligação de dímeros ao TREs. F451X (Mutante TR beta – 10 ultimos aa apartir da Fenilalanina 451, foram deletados – Hélice 12 foi eliminado, superfície de ligação ao correpressor foi exposta. )

Obrigado!!!