Prof.Ms.Emerson L.B.Lourenço. Análises Forenses Prof.Ms.Emerson L.B.Lourenço.

Toxicologia Forense Definição: Ciência que detecta e identifica a presença de drogas e venenos em fluídos corpóreos, tecidos e órgãos.

Toxicologia Forense Funções diversas; Toxicologia Forense x Toxicologia Analítica; Várias matrizes para análises; Métodos químicos sofisticados (derivação química, cromatografia, espectrometria de massa);

Compostos Voláteis Compostos da forma liquida que podem ser detectadas por técnicas de cromatografia liquida ou gasosa, quando as matrizes podem sofrerem métodos de extração apropriados. Extrações Liquído-Liquído, head space, Micro extração em fase sólida e extração em fase sólida.

Substâncias Corrosivas Incluem ácidos minerais e bases; Vários agentes corrosivos são constituintes normais dos tecidos; Modificações das concentrações químicas no plasma podem determinar as lesões;

Metais Clássicos procedimentos de separação de matrizes orgânicas são utilizados para determinação de metais ( Ex: agentes químicos e oxidação térmica); Técnicas analíticas empregadas ( Ex: AAS, MEV e ICP-MS); Diferentes formas de metais ( Mercúrio, dimetilmercúrio);

Componentes orgânicos não voláteis Drogas prescritas e ilícitas, praguicidas, produtos naturais, poluentes e compostos industriais; Dificuldade de Separação....

A N Á L I S E

Papel da Toxicologia analítica BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO NO FÍGADO E MEDULA ÓSSEA FÍGADO CytP450 CytP450 Benzeno fenol hidroquinona [O] [O] MEDULA ÓSSEA Prostaglandina sintetase Hidroquinona radical fenoxil (aplasia de medula )

Como determinar?

O que procurar nestas amostras? metanfetamina efedrina anfetamina fenilpropanolamina femproporex

ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS 1-Androstenodiol Boldenona Clostebol Estanozolol Gestrinona Nandrolona THG Oxabolona Trembolona

AGENTES ANABÓLICOS Algumas dos esteróides mais utilizados: 1. Esteróides anabólicos androgênicos Algumas dos esteróides mais utilizados: - metandienona (Dianabol), - cipionato de testosterona (Testosterona Depot, Sustanon)‏ - decanoato de nandrolona (Deca-durabolin, Durabolin)‏ - oxandrolona (Anavar)‏ - enantato de metenolona (Primobolan)‏ - estanozolol ( Winstrol)‏ - undecilenato de boldenona (Equipoise) - uso veterinário

1. Esteróides anabólicos androgênicos Agentes anabólicos 1. Esteróides anabólicos androgênicos Efeitos tóxicos -Coletases e tumores no fígado, mais freqüentemente com o uso de derivados C-17 alquilados. Carcinomas hepáticos associados aos E.A. não produzem metástase e regridem após a descontinuação do uso.

O ciclo letal de Andreas Munzer 0-10 semanas antes da competição: -Efedrina, Aspirina, Valium, clembuterol, hormônio da tireóide. 6-10 semanas antes da competição: -2 inj. Testoviron 250mg (testosterona) -1 inj. Parabolan (Trembolona) - 30 comp. Halotestin (Fluoximesterona) -30 comp. Metandienona -20 doses GH -20 doses insulina 3-5 semanas antes da competição: -3 inj. Masteron (Drostanolona) -2 inj. Parabolan(Trembolona) -30 comp. Halotestin (Fluoximesterona) -50 comp. Stromba (Estanozolol) -2 inj. Stromba -24 doses GH OUTROS: EPO, diuréticos

ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS Baixas concentrações DETECÇÃO URINA

18α-homo-pregna-4,9,11-trieno-17β-ol-3-ona O desafio dos anabolizantes Conteúdo da seringa 18α-homo-pregna-4,9,11-trieno-17β-ol-3-ona 4,9,11- trieno-3-one

Designer steroids Esteróides de desenho Tetraidrogestrinona – Conclusões de Catlin et al. i) Novo esteróide, nova “entidade química”. ii) Sem registro de CAS. iii) Nunca antes usado em humanos ou animais. iv) Nunca testado em screening farmacológico. v) Propósito único – burlar o exame de dopagem. vi) “O” esteróide de desenho.

O desafio dos anabolizantes Caracterização do THG

“CLUB DRUGS”: Freqüentadores de festas “raves”. MDMA: Ecstasy, pílula do amor. GHB: “Ecstasy líquido”. Cetamina: Special K, Kit kat. Metamfetamina: Speed, Crystal, DOB. LSD (Ácido, doce, ponto). Fenciclidina: PCP. Nitritos (Poppers).

Utilizadas em assaltos e estupros. Efeitos: Incapacidade de reação e amnésia retrógrada. Flunitrazepam (FNZ) Rohypnol FNZ ilícito GHB WWW.DEA.GOV

Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL). GHB Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL).

GHB Definição: Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL. Natural em SNC de mamíferos. Estrutura similar ao neurotransmissor GABA. Date rape drug (Relatos de uso em assaltos e estupros). Líquido ligeiram. Salgado, amargo e inodoro. Popularizado na década de 1980 - realçar o efeito do etanol . Uso crescente por todo o país. Recentemente aprovado pelo FDA como tratamento para narcolepsia. Alguns congêneres: gama-Butirolactona (GBL) e 1-4 butanediol (solventes industriais utilizados na limpeza de CDs, Impressoras).

GHB Mecanismo de ação: Receptores só no SNC, principalmente hipocampo. Liga-se fracamente em receptor GABA b. Depressor do SNC. Provoca liberação de opióides endógenos.

GHB Início de ação: 15-30 min e pico plasmático em 25-45 min. Farmacocinética: Início de ação: 15-30 min e pico plasmático em 25-45 min. Metabolizado em CO2 . GBL é convertido à GHB por via não enzimática. 1-4 butanediol é convertido à GHB pela álcool desidrogenase. Efeito Bifásico. A ingestão concomitante de etanol, leva a uma inibição competitiva pela álcool desidrogenase, retardando a metabolização do 1-4 butanediol. Assim, pode haver uma depressão inicial do nível de consciência seguido por uma melhora quando o etanol é metabolizado e logo em seguida evolução para coma com a disponibilização da álcool desidrogenase.

DOB - (Cápsula do vento) (4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-bromoamfetamina www.baladacerta.com.br surforeggae.ig.com.br

Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967. DOB - (Cápsula do vento) (4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-bromoamfetamina   Derivado anfetamínico acrescido de um átomo de bromo ( responsável por potencializar o efeito da droga e por aumentar o tempo de ação). Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967. Cápsula transparente com capacidade de 500 mg que contém cerca de 1 a 1,5 mg da substância.

Éster metil ecgonina (15-35%) Cocaína (3%) Norcocaína (2-6%) Ecgonina (1-8%) Benzoilecgonina (15-50%)

Amostras

PRAGUICIDAS a) Derivados do ácido fosfórico. b) Derivados do ácido tiofosfórico. c) Derivados do ácido ditiofosfórico. d) Derivados do ácido fosfônico.

Derivados do ácido fosfórico. Ex: Diclorvos,fosfamidon,Mevinfós, Monocrotofós.

Derivados do ácido Tiofosfórico. Ex: Cloropirifós,Diazinon,Fention,Omeotoato,Paration metílico

Derivados do ácido Ditiofosfórico. Ex:Azinfós,etion,forato,malation,tiometon

Derivados do ácido Fosfônico. Ex:Triclorfon

x Oral, respiratória e dérmica. Biotransformação Oxidação Ligação ao sitio enzimático x

Ácido Carbâmico Aldicarb,Carbaril,Carbofuran

INSETICIDAS ORGANOCLORADOS São compostos de estruturas cíclicas, bastante lipofílicos e altamente resistentes aos mecanismos de decomposição do ambiente.Os principais organoclorados com atividade inseticida são: a) Hexaclodienos e análogos. b) DDT e análogos. c) Ciclodienos. d) Dodecacloro e clordecone.

DDT 2,2-BIS(P-CLORFENIL) 1,1,1 - TRICLOETANO

DDT

CICLODIENOS Aldrin Dieldrin

PIRETRÓIDES

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICAS A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de operações unitárias necessárias para que determinada substância (analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.

Típicas operações em preparação de amostras: 1) Liberação dos analitos da amostra 2) Remoção de interferentes endógenos 3) Técnicas de extração 4) Aumento da seletividade e sensibilidade

1) Liberação dos analitos da matriz -Como se encontra o analito na matriz? -conjugado/livre -matriz?

BIOTRANSFORMAÇÃO Maconha - 9THC Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC) Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado

SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS Hidrólise -Alcalina -Ácida -Enzimática

HIDRÓLISE ALCALINA Exemplo Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado NaOH Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH

HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA Vantagens: -processo mais rápido -custo baixo - Desvantagens: -degradação de analitos não estáveis p.ex. benzodiazepínicos

HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA Benzodiazepínicos HCl 100°C 15 min. Diazepam Benzofenona

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA Beta glucuronidase 55°C Esteróides Anabólicos 1 hora Esteróides Anabólicos conjugados Esteróides Anabólicos livres

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA Vantagens: -não degrada os analitos - Desvantagens: -custo mais alto -maior tempo de reação -controle mais rigoroso das condições -enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas amostras -aconselhável o uso de controle

OUTRAS AMOSTRAS P. ex: cabelo Matriz complexa como retirar os analitos do cabelo? -digestão da matriz (solução de NaOH 1M e temperatura 70°C durante 20 minutos) substâncias estáveis (THC, anfetaminas)

OUTRAS AMOSTRAS P. ex: cabelo E para substâncias não estáveis? P.ex. cocaína -Incubação em solução ácida ou metanol durante 18 horas a 50°C

2) Remoção de interferentes endógenos Uma matriz biológica consiste de muitos componentes, como proteínas, lipídios, carboidratos que podem interferir na análise.

2) Remoção de interferentes endógenos A) Precipitação de proteínas: A remoção de proteínas por desnaturação ou precipitação é muitas vezes necessária principalmente em amostras como sangue total ou plasma. A principal razão de remover proteínas é que elas podem precipitar em contato com a fase móvel, obstruindo a coluna de HPLC.

Métodos de precipitação: a) com ácidos ( p.ex. ácido tricloroacético e ácido perclórico) -formam sais insolúveis com a forma catiônica das proteínas em meio ácido b) com solventes orgânicos -solventes que são miscíveis em água como acetona, metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a solubilidade de proteínas.

Métodos de precipitação: c) com sais metálicos: proteínas também podem ser removidas da amostra com o uso de sais de zinco ou cobre em condições alcalinas. -não : analitos que complexam com metais. b) sulfato de amônio: O sulfato de amônio é um precipitante relativamente ineficiente: < 75% das proteínas são removidas com a adição de 1,5mL de sol. Saturada em 0,2ml de plasma. Entretanto, poderia ser possível injetar o sobrenadante diretamente no HPLC.

Precipitação de pigmentos e sais biliares Pigmentos urinários e sais biliares podem produzir altos “backgrounds”que podem interferir na quantificação de analitos. A remoção desses compostos com extensos esquemas de extração podem ser relativamente difíceis ou demorados. Sua remoção pode ser feita preferencialmente por precipitação com sais de chumbo.

3) Técnicas de extração Extração líquido-líquido (LLE) Extração em fase sólida (SPE) Extração por head space (HS) Micro extração em fase sólida (SPME)

EXTRAÇÃO (líquido-líquido) urina Drogas/ metabólitos urina Solvente orgânico Agitação Centrifugação Separação da fase orgânica extrato

EXTRAÇÃO (líquido-líquido) INFLUÊNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH Forma não-ionizada H+ OH- Forma ionizada ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH

EXTRAÇÃO (líquido-líquido) INFLUÊNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas H+ Forma ionizada OH- Anfetamina Forma não-ionizada

EXTRAÇÃO (líquido-líquido) = molécula de água EFEITO “SALTING OUT” + NaCl (cloreto de sódio) Na+ Cl-

EXTRAÇÃO (fase sólida) 3mL água +3mL HCl (0,1M), secagem (5min) + 9mL metanol 3 2mL diclorometano/ isopropanol / NH3 (80:20:2) 4 2,5mL Amostra + 2,5mL água + PI + 2mL tampão fosfato BE PI Interf. COC 2 2mL Metanol + 2mL tampão fosfato 1

C8 Octil PH Fenil CH Ciclo hexil Tipos de colunas (SPE) -INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals) C8 Octil PH Fenil CH Ciclo hexil

CN Cianopropil NH2 Aminopropil 2OH Diol Tipos de colunas (SPE) -INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H) CN Cianopropil NH2 Aminopropil 2OH Diol

Ácido benzenosulfônico Tipos de colunas (SPE) -INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática) CBA Ácido carboxílico SCX Ácido benzenosulfônico SAX Trimetil aminopropil

Benzoilecgonina -metabólito da cocaína EXTRAÇÃO Forma ionizada H+ OH- Benzoilecgonina -metabólito da cocaína Forma ionizada

EXTRAÇÃO (fase sólida)

EXTRAÇÃO POR HEAD SPACE DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI seringa ESTUFA 70°C 30 min GC

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA 6 1 2 3 4 5

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) -Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) -Fibras comercialmente disponíveis:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME: -Dimensões da fibra (comprimento, espessura); -Tipo de fibra; -Temperatura de extração; -Efeito da matriz (presença de sal, pH); -Velocidade de agitação; -Tempo de extração.

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) -Influência do tempo de extração:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) -Influência da temperatura de extração:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) -Influência da concentração de sal:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) -Influência do pH:

-extração sem utilização de solventes -pode ser automatizado. MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) Vantagens da SPME sobre a SPE e extração líquido-líquido: -simplicidade -prático -rápido -extração sem utilização de solventes -pode ser automatizado.

4) Aumento da seletividade e sensibilidade -Derivação Objetivo: -melhorar as condições cromatográficas (GC) -aumentar a sensibilidade

-Derivação Ex. opiáceos Aumento da volatilidade (melhora das condições cromatográficas (GC) BSTFA 70°C 20 min

-Derivação Ex. benzoilecgonina PFP/PFPA 70°C 20 min Aumento da sensibilidade para detectores ECD PFP/PFPA 70°C 20 min

MATRIZES ALTERNATIVAS: SALIVA CABELO MECÔNIO UNHA SUOR MATRIZES BIOLÓGICAS URINA SANGUE AR EXALADO MATRIZES ALTERNATIVAS: SALIVA CABELO MECÔNIO UNHA SUOR

URINA Néfron

Disponibilidade de grandes volumes de amostra Concentração alta URINA CARACTERÍSTICAS: Coleta não invasiva Disponibilidade de grandes volumes de amostra Concentração alta Facilidade da análise (baixo custo) Possibilidade de adulteração da amostra Período de detecção: alguns dias Detecção de uso eventual

Necessidade de profissional treinado Matriz relativamente complexa SANGUE CARACTERÍSTICAS: Coleta invasiva Necessidade de profissional treinado Matriz relativamente complexa Período de detecção: algumas horas Correlação com estado clínico Maior dificuldade de adulteração

SALIVA

Coleta sob vigilância e em campo aberto SALIVA CARACTERÍSTICAS: Coleta não-invasiva Facilidade na coleta Coleta sob vigilância e em campo aberto Correlação com concentração sangüínea Período de detecção: algumas horas Pouco volume de amostra Concentração baixa

Período de detecção: meses Retrospectiva e cronológica CABELO CARACTERÍSTICAS: Coleta não-invasiva Período de detecção: meses Retrospectiva e cronológica Detecção: uso intenso Disponibilidade: ???? Adulteração: difícil Possibilidade de contaminação Baixa concentração Matriz complexa -dificuldade na análise

CABELO 1 cm 2 cm 3 cm 4 cm 5 cm 6 cm 7 cm 8 cm 9 cm 10 cm

MECÔNIO CARACTERÍSTICAS: Exposição fetal Coleta não-invasiva Matriz complexa -dificuldade na análise Período de detecção: meses Disponibilidade Possibilidade de contaminação

UNHA

UNHA CARACTERÍSTICAS: Coleta não-invasiva Baixa concentração Dificuldade na análise Período de detecção: meses Uso intenso Disponibilidade???? Adulteração: difícil Possibilidade de contaminação

Coleta através de adesivos “patch” Baixa concentração SUOR CARACTERÍSTICAS: Coleta não-invasiva Coleta através de adesivos “patch” Baixa concentração Dificuldade na análise Não existem muitos estudos Monitorar pacientes em tratamento

Aumento da seletividade e sensibilidade -Derivação Objetivo: -melhorar as condições cromatográficas (GC) -aumentar a sensibilidade

-Derivação Ex. opiáceos Aumento da volatilidade (melhora das condições cromatográficas (GC) BSTFA 70°C 20 min

-Derivação Ex. benzoilecgonina PFP/PFPA 70°C 20 min Aumento da sensibilidade para detectores ECD PFP/PFPA 70°C 20 min

Técnicas de extração e detecção em amostras biológicas de acordo com a estrutura química das moléculas

D E R I V A Ç Ã O