Avanços da Epidemiologia Genética da Hanseníase Treinamento dos procedimentos laboratoriais nas baciloscopias de hanseníase SESA Marcelo Távora Mira PUCPR 18/04/2006

Genética – Conceitos Básicos

Genética – Conceitos Básicos As questões básicas da genética são: O que nos caracteriza como espécie? Os genes determinam as características hereditárias de cada espécie O que nos caracteriza como indivíduos? Diferentes formas dos genes determinam características individuais  Alelos  variação hereditária entre indivíduos de uma mesma espécie.

O Gene Exon  sequência transcrita  codifica um peptídeo Intron  sequência não transcrita

Marcadores Genéticos Em 2003  Conclusão do sequenciamento do genoma humano  polimorfismos genéticos  principalmente microsatélites e SNPs (single nucleotide polymorphisms)

Genética de Doenças Complexas Definição  toda doença que não exibe o padrão clássico de herança Mendeliana dominante ou recessiva relativa a um único gene. Relação genótipo/fenótipo  imperfeita! Mesmo genótipo  diferentes fenótipos Mesmo fenótipo  diferentes genótipos www.cdc.gov/genomics/ search/adv_instruct.htm

Mapeamento de genes em doenças complexas Objetivo principal: Definir o(s) gene(s) envolvido(s) no controle da susceptibilidade do indivíduo à doença estudada. Aplicações: Triagem de indivíduos susceptíveis Desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas Vacinas moleculares Farmacogenômica

Genética x Doenças Infecciosas Dados epidemiológicos: Apenas uma proporção dos indivíduos expostos a um agente infeccioso são infectados; Freqüentemente apenas uma proporção dos indivíduos infectados manifestam a doença clinicamente. Era pré-microbiológica… Componente hereditário!

Genética x Doenças Infecciosas Com a descoberta dos microorganismos: Suscetibilidade a doenças infecciosas determinada por: Fatores ambientais  exposição ao patógeno Fatores sociais Fatores relativos ao microorganismo  virulência. GENES!

Genética x Doenças Infecciosas Hoje: Claro componente genético controlando suscetibilidade a várias doenças infecciosas e parasitárias. Esta evidência: Estudos observacionais Análises complexas de segregação; Estudos de genes/regiões candidatas  associação e ligação; Scans genômicos completos  ligação.

Mapeamento genético Genetic component Population-based Observational data Genetic model Segregation analysis Family-based Association analysis Non-parametric linkage analysis Parametric linkage analysis No genetic model Gene identification Gene localization

Genética x Doenças Infecciosas Exemplos: Doenças: Protozoose  malária, esquistossomose, leishmaniose. Bacterioses  tuberculose, hanseníase, salmonelose. Viroses  AIDS, hepatite B. Micoses  Pneumocystis carinii, Cryptosporidium parvum

Genética x Doenças Infecciosas Exemplos: genes: Tuberculose  VDR, NRAMP1, MLB, especificidades HLA; Hanseníase  HLA, NRAMP1, TLR2, IL10, TNFA, VDR, PARK2, cromossomo 10p13; Malária  TNFA, ICAM; Hepatite B  IL10, HLA; AIDS  HLA, CCR5.

Hanseníase Doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae Afeta pele e o sistema nervoso periférico Primeira doença para qual um agente infeccioso foi identificado  A. Hansen, 1873 Hospedeiros naturais  seres humanos e tatus

Uma família de tatus

Incidência e prevalência na India Epidemiologia da Hanseníase Doença 100% curável por MDT M. leprae não possui reservatório natural de importância biológica OMS  Campanha global de eliminação ?? Incidência Global Incidência e prevalência na India

Patogênese da Hanseníase TH1 type Tuberculoide (paucibacilar) Nada! Espectro clínico da doença exposição Borderline Lesão única, cura espontânea Lepromatosa (multibacilar) TH2 type

Genética da Hanseníase Genes candidatos: M. leprae NRAMP1 leprosy “per se” LAMA2 HLA/TNFA/TAP VDR paucibacillary multibacillary IL-10 10p13 TLR2

Design do Estudo infecção hanseníase “per se” paucibacilar multibacilar Genes candidatos Teste de hipótese Scan genômicos Geração de hipótese

As Famílias Multiplex Vietnamitas # irmãos afetados/família 2 3 4 5 # familias 63 15 6 Subtipo

Resultados do Scan Genômico Da primeira rodada 388 marcadores GATA184A08 D6S1654 D6S476 D6S2420 D6S2436 D6S1614 D6S415 D6S1035 D6S305 D6S1579 D6S1550 D6S253 D6S955 D6S1599 D6S1277 D6S503 D6S1027 D6S1590 D6S1273 1 2 3 4 Lod Score 3 cM x 11 regiões com um score (LOD) máximo > 1.0 4.31 LD mapping 89 marcadores 1 região com score (LOD) máximo > 3.6 6q25-q27 Mira MT et al., Nat Genet 2003; 33:412-415

Conclusões Identificação de um novo locus controlando suscetibilidade à hanseníase “per se”no cromosomo 6q25-q27 Mas… A região em ligação  ainda 6.4 Mb  32 genes!

De volta ao Vietnam: Mapeamento Fino - Desequilíbrio de Ligação (LD) Amostra independente de 197 famílias simplex (trios) Dados parentais completos subtipos

Mapa de Associação de Baixa Resolução Linkage Map Gene Map 32 Genes SNP Map 64 SNPs Association Plot Mira MT et al., Nature AOP, Jan 2004

Mapa de Associação de Alta Resolução 2 genes Gene map: 81 SNPs SNP map: Association plot Mira MT et al., Nature AOP, Jan 2004

Por regressão logística multivariada SNP1 SNP2 PARK2 intron 1 PACRG intron 1 p < 0.05 not significant PARK2 exon 1 PACRG exon 1

Análise de Haplótipos 1.00 3.23 5.28 [1.34 -7.82] [2.06 -13.55] OR* SNP 1 SNP 2 C T 1.00 3.23 5.28 [1.34 -7.82] [2.06 -13.55] OR* CI 95% - 0.009 0.0005 P-value * Estimada por regressão logística condicional Mira MT et al., Nature AOP, Jan 2004

Replicando o Vietnam: O Estudo Brasileiro 587 casos – 388 controles Subtipos 13 SNPs (associadas no Vietnam)

Resultados da Replicação Multivariate pGC = 2.10-5 * The position for each SNP is given as nucleotide number on build 33 of the human chromosome 6 sequence map. **q denotes the population frequency of the risk allele and was estimated from non-transmitted parental alleles in the Vietnamese sample and among unaffected controls in the Brazilian sample. ***pGC denotes the robust p-value obtained by using 24 genomic controls Mira MT et al., Nature AOP, Jan 2004

Conclusões Primeira clonagem de posição em doenças infecciosas; Identificação de fatores de risco universais para suscetibilidade à hanseníase; Link entre doenças infecciosas e neurodegenerativas!? Via da ubiquitina  papel no controle de resposta imune/inflamatória?

Na PUCPR Linha de pesquisa  “Bases moleculares da resposta do hospedeiro” Núcleo de Investigação Molecular Avançada - NIMA Infraestrutura Laboratório do NIMA  Parque tecnológico 03 Laboratório de Genômica  São José dos Pinhais Parcerias: Fiocruz IBMP McGill University Faculté de Médecine Necker – Université de Paris

Equipe 2 doutorandos 6 mestrandos 2 PIBIC  Farmácia e Biologia 1 estagiária

Projetos Estudos de susceptibilidade genética à Hanseníase Vitiligo Colônia do Prata (WHO; CNPq) Curitiba (F. Araucária) Vitiligo

Agradecimentos McGill University, Montreal, Canada Alexandre Montpetit Erwin Schurr Thomas J. Hudson Alexandre Montpetit Celestino Di Flumeri Caroline Gallant Andrei Verner Pierre Lepage INSERM U550, Necker Medical School, Paris, France Alexandre Alcaïs Laurent Abel Oswaldo Cruz Institute, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil Euzenir Sarno Milton Moraes Hospital for Dermato-Veneorology, Ho Chi Minh City, Vietnam Nguyen Thuc Minh Phuong Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands Esther van de Vosse Financial Support CIHR Genome Quebec CGDN-NCE PUCPR CAPES

Pontifícia Universidade Católica do Paraná