pDCs play off scratch Gustavo Garcia Luiz Gustavo Gardinassi Thais Herrero

Modelo de desenvolvimento das células dendríticas Para diferenciação de pDC precisa de IL-3 +ligante CD40, possivelmente é de precursor linfoide, não precisa de GM-GSF como DC convencional. Na pele TGFb induz diferenciação pra Celulas de langerhans e dermal, as celulas de langerhans pode sofre o pocesso de maturação atraves TNF e migrar para nodos linfoides e ficar como CD8int DC. A diferença das celulas dendriticas CD8+ e - dependem da localização

Função das células dendríticas Immature dendritic cells (DCs) can be polarized by type 1, type 2 and regulatory-type pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or tissue factors (TFs) to become mature effector DCs that promote the development of naive T cells into T helper 1 (TH1), TH2 or adaptive regulatory T (TReg) cells from naive TH cells. An exception is that certain pathogens might inhibit DC maturation, resulting in regulatory immature DCs. DC-polarizing tissue factors can be produced by various resident tissue cells and immune cells, including epithelial cells, natural killer (NK) cells, mast cells, macrophages, fibroblasts and many others. These cells will produce type 1, type 2 or regulatory TFs depending on their origin or the way they are activated. Skin epithelial cells, for example, produce type 1 interferons (IFNs) and interleukin-18 (IL-18) in response to double-stranded RNA and thymic stromal lymphopoietin (TSLP) in conditions of acute atopic dermatitis. By contrast, iris and retinal pigment epithelia constitutively produce transforming-growth factor- (TGF-). CCL, CC-chemokine ligand; CCR, CC-chemokine receptor; PGE2, prostaglandin E2; TCR, T-cell receptor; TNF-, tumour-necrosis factor-.

Subpopulações de Células Dendríticas CD8+ ou – depende da localização e grau de ativação CD45+

LC- células de Langerhans IDEC- células dendríticas epidermal inflamadas. PDC- células dendríticas plasmocitóides CD123- cadeia alfa do receptor da IL-3

J. Exp. Med- September 17, 2001 RT-PCR

Importância da produção dos IFNs do tipo 1 Infection with mouse cytomegalovirus (MCMV) triggers the production of type I interferons (IFNs) by plasmacytoid dendritic cells (pDCs; also known as interferon-producing cells (IPCs)) through Toll-like receptor 9 (TLR9) and the production of cytokines, such as interleukin-12 (IL-12), by DCs through TLR3, as well as type I IFN-induced production of IL-15 by DCs. IL-15 is presented to natural killer (NK) cells by the IL-15 receptor -chain (IL-15R) on the cell surface of DCs, resulting in NK-cell activation. IL-12, in combination with IL-15 and potentially other pro-inflammatory cytokines, induces the secretion of IFN by NK cells. About half of the NK cells in C57BL/6 mice express the DAP12-associated Ly49H receptor and recognize the MCMV-encoded m157 glycoprotein that is present on the cell surface of MCMV-infected cells. Interactions between Ly49H on the NK cells and m157 on the infected cells cause extensive proliferation of the Ly49H+ NK cells, as well as cell-mediated cytotoxicity (due to the directional release of perforin and granzymes) and cytokine production. IFN produced by activated NK cells amplifies the maturation and effector functions of DCs and other cells in the microenvironment. ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif. Nature Reviews Immunology 8, 259-268 (April 2008)

pDC são população de células circulantes Ausentes na pele normal, porém migram para pele inflamada Expressam TLR7 e TLR9 Produz grande quantidade de interferons tipo 1

LL37/CRAMP- peptídeo antimicrobiano catelicidina Estes peptideos são expressos nas superficies do epitelio e por neutrofilo, servem como linha de defesa contra patogeno. Antibioticos naturais- da mesma familia das defensinas.

Controle da infecção/lesão Autoimunidade

Objetivo: Avaliar o papel das células dendríticas plasmocitóides (pDCs) durante a lesão da pele e no processo de cicatrização

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs? Derme Quantificação das células dérmicas Digestão com 1mg/ml de colagenase por 2h

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs? Assim,  lesões na pele induz uma infiltração rápida e robusta de pDCs paralela à infiltração por neutrófilos no local da lesão.

Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I? Pele total (0, 6, 24, 48 e 72h) Análise da expressão gênica por Real-time PCR As pDCs são a principal fonte de IFN-α/β na lesão, enquanto as citocinas inflamatórias IL-6 e TNF são produzidas por outros tipos celulares que não as pDCs.

Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I? 2 Acs (PDCA1 e mAb 927) ou IgG como controle antes da lesão Acs (anti-Ly6C) ou IgG como controle antes da lesão 48hs 24hs 48hs 24hs 24h Demonstrando que a pele danificada induz uma rápida infiltração e ativação de pDCs.

Os TLRs estariam envolvidos na ativação pDCs e produção de INF-α/β? MyD88 -/- Pele total (24h) Análise da expressão gênica por Real-time PCR Lesão IRS 954 (0, 1, 10 ou 100μg) Lesão Pele total (24h) Análise da expressão gênica por real-time PCR

As catelicidinas são induzidas neste modelo de injúria de pele? Pele total (0, 6, 24, 48 e 72h) Análise da expressão de catelecidina (CRAMP) por Real-time PCR pDCs do baço Overnight DNA CRAMP CRAMP+DNA scCRAMP+DNA scCRAMP ELISA Sugere-se um potencial papel das catelicidinas na quebra da tolerância inata para ácidos nucléicos próprios.

As catelicidinas estariam também envolvidas com a quebra da tolerância inata contra ácidos nucléicos in vivo? CRAMP scCRAMP Salina FACs Real-time PCR Pele total (0, 24 e 48h) Sim, CRAMP é suficiente para quebrar a tolerância inata e induzir a ativação de pDCs e produção de IFNs na pele in vivo.

As catelicidinas são necessárias para a ativação das pDCs na pele danificada? CRAMP -/- Análise da expressão gênica por Real-time PCR Com ou sem lesão Pele total (24h) Assim, as cetelicidinas são suficientes, mas não necessárias para a quebra da tolerância inata a ácidos nucléicos e induz a produção de IFN-α/β pelas pDCs na pele danificada.

As pDCs induzem uma resposta inflamatória na pele danificada? 2 Acs (PDCA1 e mAb 927) ou IgG como controle antes da lesão Citocinas inflamatórias por Real-time PCR Com ou sem lesão Pele total (24h) Estes resultados demonstram que as pDCs infiltrantes, desenvolvem um papel importante na indução da resposta imune inflamatória na pele danificada, e em particular a indução de IL-6 e citocinas Th17

As pDCs teriam um papel na reepitelização da pele danificada? Análise da expressão de Keratina 6 (K6) Pele com lesão Imunofluorescência Estes resultados indicam que a infiltração das pDCs na pele danificada desenvolvem um papel importante na pele danificada promovendo uma rápida reepitelização da lesão.

Qual seria o papel dos IFN-α/β neste processo? IFNAR -/- Quantificação da Keratina 6 (K6) e análise da expressão das citocinas inflamatórias por Real-time PCR Pele com lesão Estes resultados sugerem que a capacidade das pDCs dispararem uma rápida resposta inflamatória e promoverem o reparo do tecido esta relacionado a ativação dos TLR mediada por ácidos nucléicos e produção de IFN-α/β.

E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade? 7 voluntários Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs humana) e Real-time PCR Biópsias antes e 24h depois da lesão Fita adesiva Sim, similar aos resultados obtido no modelo murino, as pDCs foram ativadas e produziram IFN-α na pele danificada.

E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade? 7 voluntários Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs humana) Lauril sulfato de sódio (SLS) Biópsias antes e 24h depois da lesão Assim como no modelo de lesão mecânica, o modelo de lesão química induziu uma rápida infiltração de pDCs e uma significante indução da expressão de mRNA de IFN-α na pele danificada.

Controle da infecção/reparo tecidual Conclusão Controle da infecção/reparo tecidual

Objetivo: Investigar o papel das pDCs na inflamção da pele de indivíduos suscetíveis a doença autoimune

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos? Linhagem 129 Tape stripping 24h Citometria de fluxo

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos? Linhagem 129 Tape stripping 24h Imunomarcação Após a inflamção, pDCs e neutrófilos infiltram-se na pele, onde pDCs produzem IFN- e neutrófilos produzem NETs.

Os IFN tipo I atuam na indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada? INFAR-/- ou WT Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR

A indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada envolve a sinalização via TLR? MyD88-/- ou WT Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR O requerimento de MyD88 na indução de genes pró-inflamatórios demonstra um importante papel da sinalização via TLR.

Os TLR7 e TLR9 estão envolvidos na indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada? IRS 954 Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR Sim, a sinalização via TLR 7 e TLR 9 é necessária para mudanças na expressão de genes pró-inflamatórios na pele danificada.

pDC e Neutrófilos são necessários para a indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada? Naive/Tape stripping 24h Real Time PCR Anti-120G8 Anti-GR1-Ly-6G WT pDC e Neutrófilos são requeridos para a indução de genes pró-inflamatórios, porém promovem respostas inflamatórias diferentes.

Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele lesionada? Tape stripping 1, 4, 20d Real Time PCR Quant. Lesão aberta Histologia (NZBxNZW)F1 C57/BL6 129

Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele lesionada? Após a inflamação, (NZBXNZW)F1 desenvolvem lesões crônicas na pele, semelhantes a lesões observadas em CLE de humanos.

pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões cutâneas? (NZBxNZW)F1 Tape stripping 15-23d Quant. Lesão aberta Anti-120G8 ou IRS 954

pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões cutâneas? (NZBxNZW)F1 Tape stripping 15-23d Quant. Lesão aberta Histologia 4d IRS 954 As pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas, pois a depleção de pDC e a inibição dos receptores tanto antes, quanto durante a inflamação, resultam em uma melhora da cicatrização.

? Conclusão Controle da infecção/reparo tecidual Autoimunidade Exacerbação da lesão Doença