DNA recombinante in a nutshell

Biologia Molecular Aplicada A tecnologia do DNA recombinante Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Teoria bem fundamentada Por volta do início da década de 70, os fundamentos básicos da teoria já haviam sido propostos solidamente por Crick, Watson e C&A Assim, os cientistas passaram a se perguntar: será que o material genético e o processo de expressão podem ser manipulados? Ciência X (Bio)Tecnologia

A descoberta da DNA ligase 1960: recombinação de DNA ocorre em células Reparo de danos ocorridos por luz UV 1967, Martin Gellert Extratos de E. coli produziam fagos lambda circulares Purificação da DNA ligase! Circularização de genomas

Paul Berg Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago lambda nele Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os juntos, utilizando DNA ligase Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente moléculas de DNA Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita nossos corpos, ele teve medo de gerar um novo e letal vírus Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em biologia molecular Nobel, 1980: “por seus estudos fundamentais em bioquímica de ácidos nucléicos, particularmente com relação ao DNA recombinante” Paul Berg, 1926- Fago λ SV40

Endonucleases de restrição 1968, Paul Arber sugere a existência de enzimas existentes em bactérias que atuassem como proteção à infecção por fagos Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios específicas Endonuclease R 1968 Meselson & Yuan: EcoRI 1970 Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta em H. influenzae -- HindIII Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta DNA exógeno mas não DNA celular Descoberta do sítio específico de corte pela enzima (AAGCTT)

Mapa de restrição 1971 - Kathleen Danna and Daniel Nathans Ensaio de digestão: Usam a endonuclease R (EcoRI) para cortar o DNA do fago SV40 Fragmentos tinham tamanho constante e, logo, podiam ser facilmente separados em uma eletroforese! Verificado o fato de que a enzima corta em sítios específicos EcoRI HindIII EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI

Mapa de restrição moderno

De novo, Berg Extremidades cegas 1972, Berg’s lab Janet Mertz and Ronald Davis descobrem que a endonuclease R1 produzia quebras espaçadas entre as duas fitas, gerando extremidades coesivas idênticas e complementares Extremidades unidas e encubadas com DNA ligase poderiam gerar moléculas de DNA híbridas! Extremidades coesivas

Ensaio de digestão Adicione DNA + tampão + endonuclease de restrição Deixe digerindo num banho a determinada temperatura por determinado tempo 1 unidade de enzima de restrição digere 1 μg DNA em 1h00 Caixa de truques do biólogo molecular contém: DNA ligase + enzimas de restrição + ...

Vetores de clonagem ~1970: Trabalho com plasmídeos Peças de DNA circulares e não cromossomais encontradas em bactérias E às vezes trocadas por elas 1970 Descobriu um método segundo o qual uma E. coli adquiriria um plasmídeo conhecido como pSC101 pSC101: contém um gene que confere resistência ao anti- biótico tetraciclina Stahen Cohen, 1936-

Plasmídeo encontra Endonucleases Herbert Boyer, 1936 Plasmídeo encontra Endonucleases Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas de restrição Trabalharam com dois plasmídeos, P1 confere resistência a tetraciclina P2 confere resistência a kanamicina Experimento Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição Incube-os com DNA ligase Teste a presença de bactérias duplamente resistentes no meio Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro organismo recombinante feito propositalmente por um ser humano EcoRI EcoRI P1 P2 EcoRI K T Digestão + ligação K P1/2 EcoRI T

Cohen & Boyer 1973 Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e verificaram que os genes estavam ativos nas bactérias depois de várias gerações Como as bactérias reproduziam-se rapidamente, poderiam ser utilizadas para produzir genes de grandes mamíferos em larga-escala Constroem um organismo capaz de combinar e replicar a informação genética de diferentes espécies!

O que, então, era possível fazer? Era possível pegar o DNA de qualquer espécie, picotá-lo e inseri-lo em uma bactéria que o amplificaria milhões de vezes A era da engenharia e da manipulação genética tem início... Mas o que se pode fazer? Até onde podemos chegar? Verdade seja dita: ninguém sabe ao certo...

Engenharia genética Pode-se aumentar a expressão de um gene bacteriano Pode-se fazer bactérias produzir genes de qualquer espécie Expressão em levedura, células de mamíferos Produzir vírus transgênicos, produzir vírus contendo toxinas Terapia gênica, knockout gênico Que medo!?

Discussões éticas 1974 Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda e se arrependeu) alerta para o perigo da biotecnologia e sugere uma moratória 1975 Conferência Asilomar Moratória de 16 meses ao DNA recombinante Bomba atômica da biologia? Watson acha que a natureza já fez muitos mais experimentos, por muito mais tempo e muitos mais jeitos do que podemos imaginar e nada de muito significativo aconteceu... Se fosse causar algum dano, a natureza per se já teria causado...

Joshua Lederberg 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma enzima) 1960 Enquanto as discussões giravam sobre clonagem humana, sugeriu que a biotecnologia se desenvolveria através da microbiologia Lederberg defendia a terapia gênica e a engenharia de fenótipos 1974, Asilomar Defendia a tecnologia para diagnose de doenças, medicina terapêutica, produção de proteínas humanas em larga escala, processos de fermentação, produção maciça de antibióticos 1978, Genentech Produção da primeira insulina humana

O DNA recombinante hoje Há centenas de vetores de clonagem comerciais, cada um com vantagens específicas (encontrar promotores, descobrir interações entre genes, expressar proteína em larga escala, etc) DNAs das mais variadas espécies são clonados a todo instante em laboratórios de biologia molecular em todo o mundo Parece que nada de muito anormal aconteceu... Ainda... Será que Watson está certo?

Plantas transgênicas Genes de resistência a patógenos Resistência a inseticidas (Roundup) Aumento da produtividade, desequilíbrio ecológico Aumento nutricional Adição de determinado aminoácido torna alimentos mais nutritivos Banana vacina Rotulação! Prejuízo ecológico da monocultura A maior parte do prejuízo ecológico vem da simples monocultura A engenharia genética adiciona um nível de prejuízo ecológico ligeiramente maior É preciso diferenciar a tecnologia de transgênicos de seu abuso pela indústria do capital Produção de insulina, hormônio de crescimento, etc.

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi Clonagem de genes Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Pra quê clonar genes? Amplificar milhares de vezes apenas este gene Realizar um estudo individual da função de genes Identificar mutações que modifiquem a função deles Entender a ação enzimática da proteína produzida Verificar com quais outros genes ele interage Produzir a proteína em larga-escala Montar genomas completos Produzir organismos transgênicos de interesse Etc etc etc etc

Clonagem de fragmentos de DNA Enzimas enzimas de restrição DNA polimerases DNA ligase/Topoisomerases Fosfatases Vetores Plasmídios Fagos Cosmídeos BACS/YACS Vírus, bacteriófagos Hospedeiros Escherichia coli Levedura Células animais Células vegetais

Vetor plasmidial Origem de replicação Gene repórter Sítio múltiplo de clonagem

Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo Produção da molécula de DNA recombinante Plasmídeo + DNA cortado do organismo de interesse Ligação das extremidades coesivas

DNA Ligase Realiza a ligação fosfodiéster E agora, quem dirá de qual organismo é esta molécula?

Ensaio de digestão e subclonagem Kb 1 2 PM 0,5 1,0 2,0 Clivagem do inserto clonado no vetor com enzima de restrição - + EcoRI

Clonagem de fragmentos de DNA INSERTO: Fragmento de DNA Ligação enzimática: Ligase de DNA VETOR ou veículo de clonagem: -plasmídeo -bacteriófago -cosmídeo cromossomo artificial de bactéria (BAC) cromossomo artificial de levedura (YAC)

Amplificação do clone em bactérias inserto fragmento de DNA ligado ao vetor construção introduzir nas células: transformação e seleção Objetivo: Obter muitas Cópias do gene pretendido bactéria transformada

Transformação Inserção do plasmídeo em bactérias Replicação bacteriana Produção em massa da proteína recombinante!

Métodos de transformação bacteriana A transformação natural descrita por Griffiths, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. Permeabilização com CaCl2 -- Choque térmico Eletroporação -- Choque elétrico Gene gun -- Bombardeamento Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente. DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático.

Seleção de clones Será que entrei? Bactérias são colocadas em meio nutritivo com antibiótico para que cresçam e amplifiquem nosso DNA do inserto Gene repórter Reporta se a transformação aconteceu Bactérias não- transformadas não sobrevivem Gene de resistência a algum antibiótico

Seleção de recombinantes Durante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem que nenhum inserto tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vetor fechado é preciso um novo teste de gene repórter.

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Material Suplementar Várias técnicas de biomol podem ser escolhidas aqui para a realização do trabalho de fim de curso: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/ http://www.nature.com/milestones/miledna/timeline.html http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_biotechnology http://www.nature.com/scitable/topicpage/Recombinant-DNA-Technology-and-Transgenic-Animals-34513 http://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-Enzymes-545