DOMINGOS, Cátia 1 ; FARINHA, Diogo 2 ; FERREIRA, Mariana 3 ; LAMY, Ana 1 ; CABRAL, Guadalupe 4 ; SILVA, Zélia 4 1 Escola Secundária da Amadora, 2 Colégio Sagrado Coração de Maria; 3 Escola Secundária José Gomes Ferreira; 4 Universidade Nova de Lisboa, Centro de Estudos de Doenças Crónicas – CEDOC – Faculdade de Ciências Médicas PROCEDIMENTO 1- ISOLAMENTO DE MONÓCITOS A PARTIR DE SANGUE PARA OBTENÇÃO DE DCs MONITORIZAÇÃO DO ISOLAMENTO - RESULTADOS EXPERIMENTAIS Método Utilizado – Citometria de Fluxo – Fenotipagem das DCs Na última década, têm-se realizado inúmeros estudos na tentativa de manipular o sistema imunitário com o objectivo de produzir vacinas celulares para usar como terapia. Neste sentido, tem-se estudado o potencial de um tipo de células do sistema imunitário – as Células Dendríticas (DCs, dendritic cells). As DCs são células com longas extensões membranares que têm elevada capacidade fagocítica no estado imaturo e capacidade profissional de apresentação de antigénios processados aos linfócitos T. A activação destes linfócitos é, por sua vez, essencial para uma resposta eficaz contra organismos invasores ou contra células cancerígenas. O processo de produção de células dendríticas para utilizar em imunoterapia envolve o isolamento de monócitos do sangue periférico e sua diferenciação in vitro em células dendríticas. Estas células são designadas dendríticas derivadas de monócitos e são re-inoculadas no paciente após terem contactado com antigénios tumorais do mesmo. Neste trabalho, procedeu-se ao isolamento de monócitos e induziu-se a sua diferenciação em células dendríticas por adição das citocinas IL4 e GMCSF ao meio de cultura. Seguidamente, induziu-se a maturação das DCs, por estimulação com LPS, e avaliou-se a eficácia desta estimulação. OBJECTIVOS Contacto com o procedimento de obtenção de células dendríticas (DCs) a partir de monócitos – Isolamento de Monócitos; Familiarização com técnicas de laboratório normalmente utilizadas para o estudo das células; Caracterização fenotípica das células nas várias fases de isolamento – Monitorização do Isolamento. A técnica de Citometria de Fluxo foi usada para: Monitorização de todas as fases do processo de isolamento de monócitos a partir de sangue periférico; Avaliação da eficácia da estimulação das DCs pelo LPS. 2- SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA COM COLUNAS LS 3- CULTURA DE CÉLULAS COM INDUÇÃO DE DIFERENCIAÇÃO EM DCs Amostra de Sangue Centrifugação Plasma Leucócitos Eritrócitos Amostra Ficoll Remoção do plasma Remoção do anel leucocitário Adição de Ficoll Centrifugação Centrifugação em anel leucocitário descontínuo Plasma Anel Leucocitário Eritrócitos e Granulócitos Ficoll Remoção do anel leucocitário Adição de PBS Duas lavagens e centrifugação com PBS Retirou-se uma alíquota para se fazer a monitorização Tampão Beads e marcação de monócitos com CD14 MicroBeads Coluna Magnética Recolha de amostra que não marca com CD14 Recolha de amostra que marca com CD14 Retirou-se uma alíquota de cada tubo de ensaio para se fazer a monitorização Universidade Nova de Lisboa, Centro de Estudos de Doenças Crónicas – CEDOC – Faculdade de Ciências Médicas (Dra. Guadalupe Cabral e Dra. Zélia Silva) e à Ci Agradecimentos: Universidade Nova de Lisboa, Centro de Estudos de Doenças Crónicas – CEDOC – Faculdade de Ciências Médicas (Dra. Guadalupe Cabral e Dra. Zélia Silva) e à Ciência Viva. Dimensão e nível de complexidade das células 1.1. Observou-se a presença de duas populações: Linfócitos e Monócitos. Gráfico 1.1.: Linfócitos – pequenas dimensões; Monócitos – maiores dimensões. Gráfico 1.2.: Linfócitos – CD14 - e CD3 + ; Monócitos – CD14 + e CD3 -. Nível de expressão de CD3 nas células Nível de expressão de CD14 nas células Observou-se que as células desta alíquota: Gráfico 2.1.: Expressavam CD3. Gráfico 2.2.: Não expressavam CD14. Foram removidos os linfócitos da amostra (CD3 + e CD14 - ) Nível de expressão de CD3 nas células Nível de expressão de CD14 nas células Observou-se que: Gráfico 2.3.: 89,13% das células não expressavam CD3; 1,52% das células expressavam CD3. Gráfico 2.4.: 89,13% das células expressavam CD14; 1,52% das células não expressavam CD3. 9,53% das células são contaminantes (granulócitos). Ou seja, 89,13% das células são monócitos, não expressavam CD3 e expressavam CD14 e 1,52% das células são linfócitos, expressavam CD3 e não expressavam CD14. Nível de expressão de CD14 nas células 1.2. t = [1;5[ dias Maturação das DCs induzida no 5º dia de diferenciação das células Monócito DC imatura DC matura Diferenciação de monócitos em células DCs t = [5;6[ dias CD14 - HLA-DR ++ CD83 - CCR7 - CD14 - HLA-DR +++ CD83 + CCR7 + Estímulo LPSCitocinas IL4 e GMLCSF 3.1. Nível de expressão de HLA-DR nas DCs 3.2. Nível de expressão de CCR7 nas DCs Observou-se um aumento na expressão dos marcadores HLA-DR e CD83( gráficos 3.1. e 3.2., respectivamente). Nível de expressão de CD83 nas DCs 3.3. Média Geométrica da Intensidade de Fluorescência (3.1, 3.2, 3.3) DC não estimuladasDC estimuladas HLA-DR219,16358,10 CD838,9329,16 CCR78,463,47 DC não estimuladas HLA-DR, CD83, CD45, CCR7 DC não estimuladas CD45 DC estimuladas com LPS HLA-DR, CD83, CD45, CCR7 DC estimuladas com LPS CD45 Legenda gráficos 3.1, 3.2. e 3.3.: Linfócitos Monócitos Contaminantes Legenda gráficos 1.1, 1.2., 2.1., 2.2, 2.3.,2.4.: CONCLUSÕES A Citometria de Fluxo é uma técnica comummente utilizada na fenotipagem e contagem de células, dado que avalia vários parâmetros como o volume, a complexidade morfológica e fluorescência da célula. Para a monitorização do isolamento de monócitos, utilizaram-se os anticorpos anti-CD3, que marcaram os linfócitos, e anti-CD14, que marcaram os monócitos. Antes de aplicar a amostra na coluna, esta continha monócitos e linfócitos. Após aplicação da amostra na coluna, obteve-se duas fracções: a CD3 + ; CD14 -, maioritariamente com linfócitos, e a CD3 - ;CD14 +, maioritariamente com monócitos. A segunda fracção tinha um grau de pureza de 89%, pelo que se conclui que o processo de isolamento foi bem sucedido. O LPS foi eficaz na indução da maturação das DCs, aumentando a expressão dos marcadores HLA-DR e CD83. Observou-se, no entanto, que algumas das DCs diferenciadas tinham iniciado o processo de maturação na ausência de estímulo (LPS), daí a presença de dois picos nos níveis de expressão de HLA-DR nas DCs não estimuladas.