José Maurício Maciel Cavalcante Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) José Maurício Maciel Cavalcante PPGCV-UECE
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) É uma metodologia de eletroforese (2D) onde é utilizado até três diferentes amostras de proteínas marcadas com corantes fluorescentes (Ex.: Cy3, Cy5, Cy2) antes da eletroforese 2D. Após a corrida eletroforética, o gel é escaneado com o comprimento de onda de excitação de cada corante um após o outro. É utilizado para observação de mudanças no perfil proteico entre amostras. Ex: Perfil de proteínas de pacientes saudáveis e doentes. Vantagem sobre a eletroforese 2D tradicional: Evita diferenças do perfil eletroforético devido à variações entre géis Consome menos tempo
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) CyDye Família cianinas (corantes sintéticos) Três corantes com diferentes comprimentos de onda de excitação e emissão: Cy2,Cy3 e Cy5
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Marcação mínima (minimum labelling) Corante ligado à N-hidroxi-succinimidila (NHS) Ligação covalente ao resíduo de lisina da proteína
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Marcação mínima (minimum labelling) Marcação de 1-2% das proteínas disponíveis e apenas uma única lisina/proteína é marcada (“um corante por proteína”) Carga da lisina carga do CyDye: pI da proteína não é alterado. Corante x PM das proteínas marcadas proteínas de baixa massa molecular Pode ser utilizado para espectrometria de massa Alta sensibilidade: detecta até 125 pg de proteína
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Marcação por saturação (saturation labelling) Apenas Cy3 e Cy5 podem ser modificados para técnica Usado para pequenas quantidades de proteína 5 µg Corantes ligados à maleimida ligação covalente ao grupo tiol dos resíduos de cisteína Todos os resíduos de cisteína são marcadas Corantes possuem carga elétrica neutra, não altera pI das proteínas
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Observações sobre a preparação das amostras - Anfólitos e DTT – competem com a ligação do marcador com a lisina Não podem estar presentes antes da reação pH 8,5 – Maior eficiência para marcação [proteína]: 1–10 mg/ml (ótimo 5 mg/ml)
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Observações sobre a preparação das amostras - 1 μl sol. de trabalho (400 pmol) em vol. de amostra com 50 μg de proteína - Homogenização (vortex) - Centrifugação (sobrenadante) - Incubação em gelo 30 min no escuro Obs: pode ser processada imediatamente ou armazenada -70oC/ 3 meses Eletroforese: placas de vidro de baixa fluorescência
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Uso do padrão interno Utilizado para eliminar a variação entre géis com uso da técnica DIGE (experimentos multi-amostra). - Uso de um pool das alíquotas proteicas - Utilizado em todos os géis DIGE Permite medir a quantidade de proteína de cada amostra em relação ao padrão interno Possibilita <10% de variação no nível de expressão proteica, com 95% de confiança
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Cy2 Cy3 Cy5 1 Pooled internal standard Control 1 Sample A1 2 Sample B2 Control 2 3 Control 3 Sample B1 4 Sample B3 Sample A3 5 Sample B4 Sample A4 6 Sample A2 Control 4 Exemplo de desenho experimental com DIGE com um controle (Control) e três tratamentos (A,B,C), cada um com três repetições (1,2,3)
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Digitalização das imagens Typhoon 9400 (GE Helthcare) Autoradiografia Fluorescência excitação azul (457, 488 nm) (Cy2) Fluorescência excitação verde (532 nm)(Cy3) Fluorescência excitação vermelho(633 nm) (Cy5) Quimoluminescência
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE) Software para a análise de experimentos com DIGE DeCyder (v7.0 - GE Healthcare) - Análise diferencial in-gel - Análise de variação biológica (entre geis) Módulo de análise estatística Remoção de artefatos Subtração background Plataforma: R$124.195,40
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