INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Prof. Valmir F. Juliano QUI624 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de métodos de via úmida Gravimetria Volumetria Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos ) Eletroanalítico Propriedades elétricas Espectrométrico Propriedades ópticas Cromatográfico Propriedades mistas* *Separação: interações físico-químicas. Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego) Histórico Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo CaCO3 mistura de pigmentos pigmentos separados 1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Definição - Princípio Básico Cromatografia Definição - Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade. A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias. A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.

Classificação das técnicas cromatográficas Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas De acordo com o sistema cromatográfico Em Coluna Cromatografia Líquida Cromatografia Gasosa Cromatografia Supercrítica Planar Centrífuga (Chromatotron®) Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Cromatografia em Papel (CP)

Classificação das técnicas cromatográficas Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas De acordo com a fase móvel Utilização de Gás Cromatografia Gasosa (CG) Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) Utilização de Líquido Cromatografia Líquida Clássica (CLC) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Utilização de Gás Pressurizado Cromatografia Supercrítica (CSC)

Classificação das técnicas cromatográficas Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas De acordo com a Fase Estacionária Líquida Sólida Quimicamente Ligadas De acordo com o modo de separação Por Adsorção Por Partição Por Troca Iônica Por Afinidade

Tipo de cromato-grafia Classificação das técnicas cromatográficas Técnica Planar Coluna Líquido Gás Líquido FM Líq Sól Líq Sól Líq Sól Troca Iônica Afinidade Fase Ligada Exclusão FE Tipo de cromato-grafia CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE

Cromatografia Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas em sobrevoando uma certa região. Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas. Fase estacionária Analitos

Cromatografia Analogia Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura. Fase estacionária Analitos

Cromatografia Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

Cromatografia Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Fase estacionária líquida suportada na celulose. Separação Fase móvel A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.

Termos e parâmetros técnicos Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Termos e parâmetros técnicos c s b a

Cromatografia de Camada Delgada - CCD FASES ESTACIONÁRIAS Sílica (SiO2) Alumina (Al2O3) Celulose Poliamida Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 oC Ativação de 10 min a 105 oC

Cromatografia de Camada Delgada - CCD ANÁLISE QUALITATIVA Comparação com valores de Rf tabelados Comparação com padrão eluído em conjunto Extração e aplicação de métodos instrumentais

Cromatografia Conclusões: Cromatografia de Camada Delgada - CCD B Após Eluição Conclusões: Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença, eluir em outros solventes Amostra

Cromatografia Cromatografia Bi-dimensional Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia Bi-dimensional Solvente 1 Solvente 2

Cromatografia Cromatografia planar Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.

Cromatografia em Coluna

PROCESSOS DE SEPARAÇÃO Cromatografia Cromatografia em Coluna PROCESSOS DE SEPARAÇÃO Exclusão Adsorção Partição Troca Iônica Afinidade

- Fase Estacionária Sólida Ligações de hidrogênio; Cromatografia Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO - Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Estacionária Sólida Processos de Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals

Diferença entre Absorção e Adsorção Cromatografia Cromatografia em Coluna Diferença entre Absorção e Adsorção

Cromatografia ADSORÇÃO Fase Estacionária Polar Cromatografia em Coluna Aumento da Atividade -CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

Celulose Microcristalina Tamanho de Partícula (mm) Cromatografia Cromatografia em Coluna 63 a 200 II e III Sílica Gel (Ácido Silícico) 75 a 150 Silicato de Magnésio Celulose Microcristalina Tamanho de Partícula (mm) I Alumina Ácida I, II e III Alumina Neutra Atividade* Adsorvente Alumina Básica *Atividade na escala Brockmann: A atividade está relacionada à quantidade de água adsorvida e é determinada em função de sua capacidade de adsorver uma série de corantes.

Cromatografia SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente Cromatografia em Coluna A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: Função solvente Solubilizar os componentes Ter baixo ponto de ebulição Função eluente Conduzir os componentes da mistura pela coluna Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE) SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético

Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO Usos: Laboratórios de química orgânica  separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese. Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa e analítica. Laboratórios de análises clínicas  separação de esteróides de urina ou de sangue, etc.

Fase Estacionária Líquida Cromatografia Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade.

Fase Estacionária Líquida Cromatografia Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade.

Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica Cromatografia Cromatografia em Coluna TROCA IÔNICA Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos. Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz

Cromatografia TROCA IÔNICA Resinas Catiônicas e Aniônicas Cromatografia em Coluna TROCA IÔNICA Resinas Catiônicas e Aniônicas FE altamente carregada Fluxo da FM Maior Interação Íons de alta carga Íons de menor tamanho A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica

Cromatografia em Coluna polialquiamina amônio quaternário ácido carboxilíco ácido sulfônico Trocador -N+ HR2Cl- Base Fraca Amberlite, Dowex, Lewatit, Zeocarb, Zerolit, Duolite -SO3- H+ Ácido Forte Nome Comercial -CH2N+ (CH3)3Cl- -CHCOO- Na+ Fórmula do Trocador Base Forte Tipo Ácido Fraco

O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas Cromatografia Cromatografia em Coluna O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas

Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. - Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar

Características desejáveis para os Géis Cromatografia Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Características desejáveis para os Géis Inércia Química: Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto. Estabilidade: O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH. Baixo teor de íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.

Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose Fluxo da FM

Fase Estacionária Sólida Cromatografia Cromatografia em Coluna AFINIDADE Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Propriedades Biológicas e Funcionais

Cromatografia AFINIDADE Possibilidade de Ligação Substância Cromatografia em Coluna AFINIDADE Lectinas, proteínas específicas da superfície da célula Células Antígenos, células Proteínas trasnportadoras, receptores Sequência de bases complementares, histonas, enzimas específicas Substratos, cofatores, inibidores competitivos Possibilidade de Ligação Anticorpos Enzima Hormônios e Vitaminas Substância Ácidos Nuclêicos

Sem importância na CG, mas com grande importância na CLAE Cromatografia Teoria Básica Sem importância na CG, mas com grande importância na CLAE SOLUTO ⇌ FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA

Cromatografia Teoria Básica Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel: Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM. MENOR RETENÇÃO !!! Volatilidade [A]FM Afinidade pela FE [A]FE KC = Constante de Distribuição [A]FE = concentração do analito na FE [A]FM = concentração do analito na FM

Cromatografia N Quantificação da eficiência Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Coluna mais eficiente tR wb N

“Tamanho” de cada estágio de equilíbrio Cromatografia Quantificação da eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) “Tamanho” de cada estágio de equilíbrio Valores típicos de H e N: Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m dc = diâmetro da coluna em mm df = espessura da fase estacionária em mm (L = comprimento da coluna) Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes

Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Detecção Fase móvel Separação

Cromatografia Cromatografia em fase gasosa Injetor: submetido à temperatura controlada Detector: submetido à temperatura controlada Fase móvel: gás inerte Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas

Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.

Cromatografia Gasosa Equipamento 1 6 2 4 5 3 1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). Observação: em azul: temperatura controlada

Requisitos - Gás de arraste (FM) Cromatografia Gasosa Requisitos - Gás de arraste (FM) INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis com DCE H2O, O2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

Requisitos - Gás de arraste (FM) Cromatografia Gasosa Requisitos - Gás de arraste (FM) CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. CUSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: He , H2 DCT DIC N2 , H2 DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4

Cromatografia Gasosa Injetor Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica t = 0 t = x Injeção instantânea: t = 0 t = x Injeção lenta:

Cromatografia Gasosa Injetor “on column” 1 2 1 - Septo (silicone) 3 4 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica

Cromatografia Gasosa Injetor “on column” 1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna. 3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

Cromatografia Gasosa Parâmetros de injeção TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição. Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil. VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra. COLUNA Amostras Gasosas Líquidas empacotada  = 3,2 mm (1/4”) 0,1 mL ... 50 mL 0,2 L ... 20 L capilar  = 0,25 mm 1 mL ... 100 mL 0,01 L ... 3 L Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

Microsseringas para injeção Cromatografia Gasosa Microsseringas para injeção LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Microsseringa de 10  L: Microsseringa de 1  L (seção ampliada): corpo guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) agulha

Cromatografia Gasosa Colunas EMPACOTADA  = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR  = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida

Estrutura química do analito Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0). p0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)

AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG

Programação linear de temperatura Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos TCOL ALTA: - Componentes mais voláteis não são separados - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente

Programação linear de temperatura Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TEMPO TEMPERATURA tINI tFIM TINI TFIM R TINI - Temperatura Inicial TFIM - Temperatura Final tINI - Tempo Isotérmico Inicial tFIM - Tempo Final do Programa R - Velocidade de Aquecimento

Programação linear de temperatura Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Isotérmico a 45 ºC; isotérmico a 145 °C; programado de 30 ºC a 180 ºC

Programação linear de temperatura Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidade vazão DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida

Cromatografia Gasosa Fase Estacionária REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência

Fase estacionária sólida Cromatografia Gasosa Fase estacionária sólida O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida ADSORÇÃO Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) Solutos polares Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)

Fase estacionária líquida Cromatografia Gasosa Fase estacionária líquida O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) ABSORÇÃO Filmes espessos de FE líquida Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)

Fase estacionária quirais Cromatografia Gasosa Fase estacionária quirais As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos. FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica. PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).

Cromatografia Gasosa Detectores Características ideais: Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. Características ideais: Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. Boa estabilidade e reprodutibilidade. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC. Tempo de resposta curto e independente da vazão. Alta confiabilidade e facilidade de uso. Similaridade de resposta para todos os solutos. Não destrutivo.

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Cromatografia Gasosa Detectores REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

Cromatografia Gasosa Detectores DCT DCE DNP SELETIVOS: UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. DCT DCE DNP SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

Cromatografia Gasosa Detectores DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.

Cromatografia Gasosa Detectores DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (104). DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 (X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108). DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (104) DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)

Cromatografia Gasosa Detectores Detecção TIC SIM CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z. Detecção TIC Universal Similar a DCT SIM Seletivo Maior Sensibilidade

Cromatografia Gasosa Detectores CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. MASSA / CARGA CONTAGENS Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa. TEMPO CONTAGENS

Cromatografia Gasosa Detectores CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. MASSA / CARGA CONTAGENS Cromatograma de íons selecionados: SIM Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada. TEMPO CONTAGENS Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os demais.

Interface Capilar Direta Cromatografia Gasosa Detectores CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM. CG EM Vácuo Câmara de Ionização Coluna Capilar Separador Molecular O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo. Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.

Cromatografia Gasosa Análise qualitativa O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’: tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tR tM tR’ = tR - tM TEMPO SINAL tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)

Como se explica esta ordem de eluição? Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 mL Como se explica esta ordem de eluição? Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor e). Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.

O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: Cromatografia Gasosa Análise quantitativa O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica. Área da banda cromatográfica. TEMPO SINAL Área Altura

Cromatografia Gasosa Análise quantitativa Área amostra Concentração tempo

A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente Cromatografia Gasosa Análise quantitativa MASSA ÁREA A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente MASSA ÁREA / MASSA 0,95 S 1,05 S O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear:

Cromatografia Líquida Cromatografia em fase líquida

Cromatografia Líquida Cromatografia em fase líquida Complete e ganhe 5 pontos: A. Solventes B. C. D. E. F. G. H. I. J. K. Computador L. Impressora

Cromatografia Líquida - CLAE Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CLAE ? para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000. DE FORMA GERAL: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.

Partição em fase reversa Partição em fase normal Cromatografia Líquida Insolúvel em água Solúvel em água Aumento de polaridade Polar não iônico Apolar Iônico Massa molecular 102 103 104 105 106 Troca iônica Partição Partição em fase reversa Partição em fase normal Exclusão Permeação em gel Filtração em gel Adsorção Tipos e Aplicações da Cromatografia Líquida

Esquema de um equipamento completo para CLAE Cromatografia Líquida Esquema de um equipamento completo para CLAE

Cromatografia Líquida Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 – Geração de pressões até 6.000 psi 2 – Saída com ausência de pulsos 3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min 4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor 5 – Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma)

Cromatografia Líquida Sistemas de injeção de amostras Suportam pressões de até 7.000 psi Volumes típicos: 5 a 500 mL Microamostragem: 0,5 a 5 mL

Cromatografia Líquida Fase móvel para CLAE Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação. Eluição isocrática: Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. Eluição com gradiente: São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade. Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos. A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG.

Cromatografia Líquida Eluição com gradiente Coluna C18, 5 mm, fase reversa Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm

Cromatografia Líquida Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi. Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.

Cromatografia Líquida Colunas para CLAE Remoção de material particulado Contaminantes do solvente Contaminantes da amostra Saturar a FM com a FE Pré-coluna Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS Material: aço inox Comprimento: 10 a 30 cm Diâmetro: 4 a 10 mm FE: Partículas de 5 a 10 mm Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro

Cromatografia Líquida Separação isocrática de alta velocidade - 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i. - FE: spherisorb 3 mm Coluna de alta velocidade e alta eficiência FM: 4,1% EtAc em n-Hexano 100.000 pratos/metro 1– p-xileno 2- anisol 3- acetato de benzila 4- dioctil-ftalato 5- dipentil-ftalato 6- dibutil-ftalato 7- dipropil-ftalato 8- dietil-ftalato

Basicamente são dois tipos de FE: Cromatografia Líquida Fase estacionária para CLAE Basicamente são dois tipos de FE: Pelicular: Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm, recoberto com uma camada fina e porosa de: Sílica Alumina Resina de poliestireno-divinil-benzeno Resina trocadora de íons Partícula porosa: Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 mm. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.

Cromatografia Líquida Detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores: Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica). Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc). Características ideais: Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. Boa estabilidade e reprodutibilidade. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. Tempo de resposta curto e independente da vazão. Alta confiabilidade e facilidade de uso. Similaridade de resposta para todos os solutos. Não destrutivo. Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.

Cromatografia Líquida Detectores Absorbância UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105 IV Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103 Índice de refração (universal) – S: 10-7 g/mL – FL: 104

Cromatografia Líquida Detectores Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade. Amperométricos Coulométricos Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104 Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106

Cromatografia Líquida Detectores Espectrometria de massa - universal Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM. Interface CL-EM

Cromatografia Líquida Detectores Espectrometria de massa TIC TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA SIM TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra. Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa. Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água) FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel. Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Campo Misturas típicas Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC. TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade de troca iônica. EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.

Cromatografia Para refletir e responder: A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito? A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre?

F I M