Introdução Automatização dos processos de sequenciamento Base-calling Automatização dos processos de sequenciamento Mecanismos pré-definidos (não-humanos) para correção de erros Sequenciadores com programa próprio de correção de erros e base-calling Programas que possam ser adaptados para diferentes sequenciadores de diferentes empresas

Seqüenciamento Método de Sanger, 1977 Primeiros sequenciamentos: Marcação radioativa; 1tubo/dideoxinucleotídeo (4/sequenciamento). Sequenciamentos modernos: Marcação com diferentes ddNTP fluorescentes; 1tubo/sequenciamento. Análise informática para definição da correta seqüência de nucleotídeos da amostra

Análise Informática Line tracking - identificação das extremidades do gel Lane profiling - somatória dos 4 sinais para identificar cada sequenciamento Trace - conjunto de quatro sequências indicando as intensidades de cada sinal e os tempos de espaço de durante a corrida - representado como cromatograma Trace processing - processamento dos sinais para corrigir estimativas de sinal, diminuir o ruído e considerar as diferenças de mobilidade dos fragmentos eletroforéticos Base calling - o arquivo processado é transformado em uma seqüência de bases, com valores de confiabilidade

Problemas Mobilidade dos fragmentos pequenos Compressões - bases na extremidade final fazem um hairpin e movem-se mais rapidamente, mais comum quando a seqüência é rica em GC. Dye-terminator parecem resolver o problema Diferença na intensidade dos picos ou alto valor de ruído, caracterizando uma base Problemas em seqüências após repetições de mono ou dinucleotídeos

Base-calling Localização dos picos preditos, verificação do espaçamento entre eles Identificação dos picos observados no arquivo trace Sobreposições dos picos observados nos picos preditos Picos não sobrepostos são checados para verificar se representam uma base verdadeira, se sim, essa base é inserida na sequência

Arq. Base-called Apresenta um arquivo FASTA contendo um número no local de cada base, que representa a qualidade dessa base Qualidade -10 * log_10 (P_e) onde P_e é a probabilidade de que a o base call esteja errado PHRED www.phrap.org

Trat. posteriores Utilização de programas para realizar o agrupamento das seqüências num projeto genoma Programas de clustering utilizam a qualidade da seqüência e aumentam essa qualidade de acordo com o número de sobreposições da mesma base em diferentes seqüências