Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis Revisão bibliográfica Os antígenos Extração Purificação Material e método Oi pessoal, Apresentarei a vocês hoje a primeira parte de meu projeto de doutorado. Lembro a vocês que no meu projeto global, pretendo estudar a influência dos principais antígenos de C. pseudotuberculosis sobre elementos da resposta imunológica celular em caprinos. A primeira fase do meu trabalho será portanto extrair, isolar e purificar os principais antígenos da Coryne. Irei apresentar-lhes primeiro uma rápida descrição das frações antigênicas das bactérias gram +, em seguida, falarei sobre os principais antígenos até hoje descritos assim como as técnicas de extração e purificação usadas com esta bactéria. Em seguida, irei apresentar a filosofia e as técnicas escolhidas para tentar alcançar meu objetivo.

Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C. pseudotuberculosis Ag. Extra celulares Ag. de parede / membrana Peptidoglicano Ácidos teicóicos Antes de falar das frações antigênicas, queria insistir sobre uma particularidade de C. pseudotuberculosis. À diferença da maioria das outras bacteria s gram +, a parede de C.pseudotuberculosis é coberta por uma camada lipídica, a origem de todos nossos problemas. Deve-se lembrar que esta camada participa da virulência (Jolly, 1966) mas não da imunogenicidade de C. pseudotuberculosis (Cameron et al, 1969). Atualmente, são distinguidas somente duas frações antigênicas, uma extracelular e outra ligada à bacteria. Este projeto objetiva diferenciar 4 frações: intracelular, ag. de parede, S-Layer e extracelular. Ag. Intra celulares? Membrana Parede Camada lipídica Ag. fracamente ligados à parede

A parede é constituida de várias camadas de peptidoglicanos A parede é constituida de várias camadas de peptidoglicanos. O peptidoglicano é formado de uma sequência alternada de N Acetyl Glucosamina (NAG) e de Ácido N Acetyl Muramínico (NAMA). Cada camada de peptidoglicano é ligada à outra por ponte de AA e derivados de AA.

A título indicativo, apresento a seguir os resultados de um trabalho antigo de Cameron (1971) cujo objetivo era de extrair os antígenos de Coryne. Descrever os tratamentos e os resultados. Ler as conclusões.

6 antígenos reencontrados frequentemente : 2 bem descritos: 31 kda a exotoxina, 39-40 kda CP40 com atividade serina protease, e 4 com atividades ainda não conhecidas (<=25, 55, 64 e 68 kda)

Considerando-se um mínimo de 3 referências por antígeno de PM similar, podemos definir 9 prováveis antígenos imunodominantes na fração celular: <22, 31, 36, 40, 55, 64, 79, 100 e 120. Destes, 4 parecem comuns aos antígenos extracelulares (31, 40, 55 e 63).

As frações antigénicas de Corynebacterium pseudotuberculosis Antígenos extracelulares Antígenos fracamente ligados à parede Apresentar resultados de Muckle. Pequena dúvida a respeito do antígeno de 43 Kda que não é encontrado na fração extracelular nem na celular. Antígenos celulares (parede/membrana, intracelulares)

Extração dos antígenos de C. pseudotuberculosis Os sonicados da literatura são mais violentos do que as metodologias usadas no ICS. Lizozima, não. N-Octyl Glucoside, não iônico e com peso molecular da micela baixa, caro. Gostaria de evitar 60ºC. Semelhança dos resultados entre detergentes.

Purificação dos antígenos de C. pseudotuberculosis Insistir sobre o fato de estas purificações terem sido feitas na maioria das vezes com a fração extracelular. Outra conclusão, influência negativa da precipitação pelo Sulfato de Amónio.

Introduzir ou reintroduzir a filosofia geral que vai nortear o meu trabalho. Na escolha das técnicas de extração e purificação que irei apresentar a vocês, o lema foi de preservar obsessionalmente a estrutura da proteina. Em outros termos, o desafio é de extrair e purificar todos os antígenos com grande carinho . Falar das extrações. Das 4 frações antigênicas. Das interrogações a respeito da fração intracelular.

S-Layer (1)

Extracelulares (4)

Não entrarei no detalhe dos procedimentos, somente as grandes linhas. Sonicado: Comparar método em uso hoje com procedimentos mais demoradores Elementos de escolha dos detergentes: CHAPS e TRITON X-100, OK; DOC aniónico menos desnaturante que SDS; SDS, meu controle. Os inhibidores serão utilisados em routina sobretudo porque iremos trabalhar a temperaturas fisiológicas. Quando chegar na fase 4, teste da vantagem da presênça deles. Celulares (3)

Obtenção de soro para imunodifusão e Cromatografia de imunoafinidade (E. Harlow and D. Lane, 1988, Weare et al, 1982) Imunodifusão Frações antigénicas extraídas (4) C. Imunoafinidade Reversa Frações obtidas a partir de PAGE NÃO DESNATURANTE Esquema de vacinação: (3 coelhos por extrato) Injeção inicial SC: 0,5 mg de proteína com adjuvante de Freund completo, Boosts a cada 30 dias, 0,25 mg, SC (Freund incompleto) ou IV (Ag sem adjuvante) Sangria 15 dias após cada boost. Preparação do soro: Aquecimento 56ºC, 30 min. Precipitação com (NH4)2SO4 ou Cromatografia Exclusão Resuspensão em NaHCO3 (CIAR) Desalinização (Diálise ou Sephadex G-25) (ID)

Estamos prevendo dois procedimentos em função dos níveis de contaminantes dos vários extratos. Procedimento para 1 e 2, Procedimento para 3 e 4. Detalhe do procedimento com CIAR no próximo slide

+ Cromatografia de Imunoafinidade Reversa PAGE não desnaturante Celulares (3) Extracelulares (4) PAGE não desnaturante Bandas contaminantes Gel de Sepharose 6MB ativado com Brometo de cyanógeno Sóro anti “Contaminantes” + Cromatografia de Imunoafinidade Reversa

Extração por detergentes/Sonicado Controle de qualidade Extração por detergentes/Sonicado Outros Extratos E. Intracelulares (2) Lowry PAGE / Imunoblot E. S-Layer (1) E. Celulares (3) E. Extracelulares (4) EXTRAÇÃO Soro ID (4) Extratos 1 e 2 Extratos 3 e 4 Lowry Soro ID PAGE / Imunoblot C. I. A. R. C. Exclusão C. Exclusão PURIFICAÇÃO