MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA Centro de Ciências Biológicas Departamento de Microbiologia e Parasitologia Microbiologia Geral Profº Admir José Gianchini MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA Alceu Alves Azambuja Aline Zanini Carpes Andre Buitoni Lais da Silva Bellettini http://www.piauinet.com.br/ciencia/

Biogeografia O que é? Se aplica a microorganismos?

Diversidade Riqueza Equilíbrio A biodiversidade de plantas e animais são grandemente conhecidas e estudadas, enquanto a diversidade de microorganismos é, na sua maior parte, desconhecida. Microorganismos apresentam riqueza em diversidade molecular e química, visto que eles estão na base de processos básicos do ecossistema. Há somente 1,7 milhão de espécies descritas.

Porque estudar a diversidade microbiana? São muito utilizados para… Produção de alimentos; Bebidas; Fertilidade do solo; Biotecnologia; etc Além das várias utilidades nas nossas indústrias, conhecendo os microorganismos é possível conhecer e resolver doenças.

Dependentes de cultura Métodos de avaliação Dependentes de cultura Bactérias são isoladas do ambiente e postas em cultura; Ácido nucléico é extraído da cultura de bactérias para fins de identificação. Desvantagens: Não é possível cultivar uma ampla variedade de microorganismos; As bactérias isoladas representam uma pequena parte do que está realmente presente naquele local.

Independentes de cultura Ácido nucléico é extraído diretamente das amostras coletadas; Geralmente é feita a amplificação do DNA a partir do RNA extraído, por PCR; Análise da diversidade nas amostras amplificadas; Pode haver clonagem e sequenciamento do amplificado para identificar e enumerar as espécies bacterianas presentes na amostra. A extração de ácidos nucléicos diretamente das amostras do ambiente, chama a atenção para a grande proporção de microorganismos que não são facilmente cultivados em laboratório, mas que tem grande importância em atividades de biodegradação.

Genetic Fingerprinting Técnicas de “impressão digital genética”, como a “independente de cultura”, demonstram o perfil da diversidade genética de uma comunidade microbiana. Recentemente várias destas técnicas tem sido desenvolvidas e aplicadas em estudos de ecologia microbiana, como biorremediação. A separação ou detecção de pequenas diferenças nas sequencias de DNA específicas podem dar informações importantes sobre a estrutura da comunidade e a diversidade de microorganismos que contém um gene crítico.

Diversidade microbiana do solo Fungos e bactérias do solo atuam em diversos ciclos biogeoquímicos, sendo responsáveis pela ciclagem de compostos orgânicos; Contribuem para nutrição de plantas; Fornecem estrutura e fertilidade ao solo. Limitações do estudo A maioria dos microorganimos não é cultivável por métodos laboratoriais; O solo é heterogêneo – uma amostra pode conter mais de uma espécie que de outra ou até mesmo não conter muitas espécies presentes neste solo. Há limitações também nos métodos moleculares – lise da célula para extração, interferência de outros compostos no resultado, etc; Taxonomia – problemas na definição das espécies.

Métodos de estudo da diversidade microbiana do solo Técnicas baseadas em bioquímica Contagem em placas Faz-se por plaqueamento seletivo e contagem dos viáveis; Limitações: Dificuldade em desalojar bactérias e esporos das partículas do solo; Condições de crescimento (pH, temperatura, luz) Inabilidade de cultivar diversos microorganismos; Possibilidade de uma colônia inibir o crescimento de outra; Crescimento em placas favorece microorganismos com alta taxa de crescimento ou, no caso dos fungos, aqueles que produzem muitos esporos.

Perfil fisiológico da comunidade microbiana (uso do carbono) (SSCU) Como funciona? - Placas possuem 95 espaços, cada um com uma fonte diferente de carbono e uma tinta roxa (inativada), além de um espaço vazio (controle negativo). - Se, e quando, o microorganismo começa a utilizar a fonte de carbono, a tinta roxa é reduzida e começa a tingir o espaço. - A análise geralmente é feita durante 2 a 5 dias. Para que é usado? - Avaliar o potencial metabólico de comunidades de microorganismos em locais contaminados, solos árticos, solos tratados com herbicidas, entre outros. - Estimar diversidade de microorganismos. (riqueza nas respostas) - Estimar similaridade entre comunidades. (padrão de desenvolvimento) - Determinar facilidade/dificuldade no uso do carbono. (taxa de mudança da cor em cada espaço)

Incubadora - Leitora Incubadora aberta: capacidade para 50 painéis

Usado somente para microorganismos cultiváveis em laboratório; Limitações: Usado somente para microorganismos cultiváveis em laboratório; Favorece microorganismos com alta taxa de crescimento; Caracteriza o potencial metabólico e não a diversidade; Superestima a contribuição de especies em maior quantidade; As fontes de carbono podem não representar o que há realmente no solo. Links: Vídeo 1 , Vídeo 2 Nesses vídeos você acompanha em 8 segundos o que ocorre em aproximadamente 65 horas nos painéis de carbono.

Análise de ácidos graxos (FAME – Fatty Acid Methyl Ester analysis) Não depende de cultura; Informa sobre a composição das comunidades microbianas com base nos agrupamentos de ácidos graxos; Tem sido usado para avaliar a mudança na composição das comunidades expostas a agentes contaminantes e práticas de agricultura; Ácidos graxos são extraídos diretamente do solo; Metilados; Analisados por cromatografia de gás.

Limitações: A composição celular dos ácidos graxos pode ser influenciada por fatores como temperatura e nutrientes; Outros organismos podem confundir as análises; Individualmente, os ácidos graxos não podem ser utilizados para diferenciar espécies, visto que diferentes espécies podem possuir o mesmo ácido graxo. Ademais, uma mesma espécie pode possuir mais de um ácido graxo característico.

Técnicas baseadas em estudos moleculares Conteúdo de Guanina e Citosina (G+C) Usado para estudar a diversidade de bactérias em comunidades de solo Microorganismos possuem diferenças no seu conteúdo G+C. Grupos relacionados taxonomicamente diferenciam-se em apenas 3% a 5% Não há erros por influência do PCR Pode detectar membros raros de uma população Uma das maneiras mais comuns de medir é através de temperatura de derretimento da dupla-hélice de DNA. (espectrofotômetro, 260nm, absorbância) Limitações Requer grandes quantidades de DNA (até 50 microgramas) Diferentes grupos taxonômicos compartilham a mesma quantidade de G+C

Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização Extraçao do DNA de amostras do ambiente; Purificação; Desnaturação; Reanelação. A quantidade de hibridização depende da similaridade entre as sequências presentes; O tempo que metade do DNA leva para se reassociar (the half association value C0t1/2) pode ser usado como um índice de diversidade. Limitações: Pouca sensibilidade – se as sequências não estiverem em grande número, não serão detectadas (PCR pode resolver – amplificação)

Abordagens baseadas em PCR DNA é extraído da amostra; Purificado; Primers específicos ou universais; Os produtos resultantes são separados de diferentes maneiras. Marcações de rDNA 16S por PCR tem sido usadas para estudar a diversidade de procariotos – permite identificação e previsão de relacionamentos filogenéticos; rDNA 18S e espaçadores de transcritos internos (ITS) tem sido utilizados para estudar comunidades fúngicas.

DNA é extraído das amostras do solo; Eletroforese em gel de gradiente desnaturante – DGGE / Eletroforese em gel de gradiente de temperatura – TGGE DNA é extraído das amostras do solo; Amplificado por PCR com primers universais – para marcar rRNA 16S ou 18S; O terminal 5’ do primer; Separação Limitações: Trabalhosa manipulaçao da amostra – do contrário pode influenciar o resultado. Eletroforese em gel de poliacrilamida

Polimorfismo de conformação de fita simples – SSCP DNA de fita simples é separado por eletrofores em gel de poliacrilamida. Esta técnica tem sido utilizada para medir a sucessão de comunidades bacterianas, comunidades da rizosfera, entre outros. Limitações: Trabalhosa manipulação da amostra – evitando influenciar o resultado. Eletroforese em gel de agarose

Polimorfismo de restrição de comprimento do fragmento – RFLP / Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado No PCR rDNA é amplificado e digerido por enzimas de restrição dos 4 pares de base; Fragmentos de diferentes tamanhos são formados e detectados utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose. Este método é útil para detectar mudanças estruturais em comunidades microbianas mas não para medir diversidade ou detectar grupos filogenéticos específicos.

Polimorfismo de fragmento de restrição terminal – T-RFLP Segue o mesmo princípio da técnica de RFLP; Porém um primer é marcado com um marcador fluorescente. Limitações: Extração de DNA; Escolha do primer – nenhum primer universal é capaz de amplificar todas as sequências dos 3 domínios; Pode subestimar a verdadeira diversidade, pois somente as espécies mais numerosas são detectadas; Digestão incompleta pelas enzimas de restrição pode levar à superestimação da diversidade.

Análise de espaçador intergênico ribossomal – RISA / Análise de espaçador intergênico ribissomal automático – ARISA A região espaçadora intergênica (IGS) entre as subunidades ribossomais 16S e 23S á amplificada por PCR; É feita a desnaturação; É separada por eletroforese em gel de poliacrilamina. Esta região codifica tRNAs e é útil para diferenciar cepas bacterianas e espécies muito relacionadas, por causa da heterogeneidade do comprimento e da sequência da IGS; O método ARISA difere do RISA por utilizar primers marcados com fluorescência que pode ser detectado automaticamente. Limitações: As mesmas esperadas em toda a técnica que envolve PCR – dificil manipulação, escolha do primer, etc.

Caracterização de sequências altamente repetitivas / Regiões de microsatélites Sequências de microsatélites podem ser diagnósticas e permitem diferenciação de espécies; Microsatélites amplificados por PCR podem ser comparados usando índices de similaridade para investigar diferenças inter ou intra-específicas. Limitações: A sequência do microsatélite deve ser conhecida – para a escolha do primer; Depende da complexidade da comunidade.

Conclusão Vários métodos disponíveis; Cada um tem suas vantagens e desvantagens; Recomenda-se utilizar mais de um método para resultados mais confiáveis e precisos.

Referências Kirk, Jennifer L. Beaudette, Lee A. Hart, Miranda. Moutoglis, Peter. Klironomos, John N. Lee, Hung. Trevors, Jack T. Methods of studying soil microbial diversity. 15 jun. 2004. Journal of Microbiological Methods – 58 (2004) . p.169– 188. Kapur, Manisha. Jain, Rakesh Kumar. Microbial Diversity: Exploring the Unexplored. India. Institute of Microbial Technology. Fierer, Noah. Microbial biogeography: patterns in microbial diversity across space and time. In: Accessing Uncultivated Microorganisms: from the Environment to Organisms and Genomes and Back. K. Zengler (editor). ASM Press, Washington DC pgs. 95-115.