Microrganismos e Biotecnologia

1. Introdução Microrganismos como elementos-chave em processos biotecnológicos Microbiologia industrial = otimização de certas reações para produção de compostos de interesse Biotecnologia = microrganismos normalmente geneticamente modificados visando a produção de produtos que normalmente eles não são capazes de produzir

1. Introdução ? Biotecnologia é apenas transformação genética

1. Introdução Biotecnologia Tratamento de efluentes Transformação genética Biocombustíveis Biotecnologia Biorremediação Alimentos Produção de compostos: enzimas, antibióticos, aa, hormônios, vacinas, etc.

2. Microbiologia Industrial 2.1. Principais organismos Fungos = leveduras e filamentosos Actinobacterias = Streptomyces 2.2. Características dos microrganismos empregados em processos biotecnológicos: * Crescer in vitro * Crescer em larga escala * Não ser fastidioso * Crescer mesmo em condições subótimas * Ser de fácil manutenção * Não ser patogênico * Ser facilmente manipulável e geneticamente estável

2. Microbiologia Industrial

2. Microbiologia Industrial 2.3. Produtos As próprias células microbianas: alimentos ou agentes imunizantes (leveduras) Moléculas de alto PM: enzimas (glicose isomerase – xaropes) Produtos metabólitos primários (produzidos durante a fase exponencial de crescimento): p. ex. vitaminas Produtos metabólitos secundários (produzidos durante a fase final de crescimento): ex. antibióticos, esteróides, alcalóides, etc. Produção de químicos especiais: aspartame, etc. Compostos químicos de conveniência: etanol, ácido cítrico, etc.

2. Microbiologia Industrial Metabolismo secundário: penicilina por Penicillium chrysogenum Metabolismo primário: álcool por leveduras

2. Microbiologia Industrial 2.4. Processos Produção de fármacos: antibióticos, esteróides, insulina Produção de químicos valiosos: solventes, enzimas Produção de suplementos alimentares: probióticos, etc. Produção de bebidas alcoólicas: cerveja, vinho, destilados, etc. Produção de vacinas (principalmente antivirais) Controle biológico de pragas e doenças: B. thuringiensis, Beauveria, etc. Uso de microrganismos na mineração e na indústria do petróleo Biorremediação/fertilidade dos solos: micorrizas, FBN, etc.

3. Produtos para a indústria alimentícia 3.1. Leveduras como alimento e suplemento alimentar A grande maioria Saccharomyces cerevisae Produzidas em tanques de fermentação (40 a 200 mil litros) Levedura ativa desidratada: fermentos Levedura nutricional (morta e seca): rica em vitamina B e proteínas

3. Produtos para a indústria alimentícia

3. Produtos para a indústria alimentícia 3.2. Microrganismos na produção de vinhos Leveduras selvagens e leveduras cultivadas (S. ellipsoideus) Fermentadores de até 200 mil litros (carvalho, cimento, pedra, vidro) Vinho branco, tinto e rose Sulfitos (Na2S2O5) para eliminar leveduras selvagens que podem conferir sabores indesejáveis ao produto Fermentação malolática (ácido málico) com produção de ácido lático, diacetil e acetoína que dão sabor amanteigado ao produto: Lactobacillus Pediococcus Oenococcus Enterococcus

3. Produtos para a indústria alimentícia 3.3. Microrganismos na produção de cervejas A partir de grãos maltados: grãos de cevada germinados (enzimas que que digerem o amido convertendo-o em açúcar – Rhizopus ou germinação Maceração dos grãos Cozimento: desativar enzimas, proteínas e aminoácidos (1 hora a 65-67 C) Adição de lúpulo (aromatizante e antimicrobiano) Fervura para liberar ação do lúpulo e término da coagulação de proteínas Filtragem Resfriamento Fermentação: alta fermentação: leveduras em todo o mosto (ales) – S. cerevisae baixa fermentação: no fundo do tanque (cervejas claras) – S. carlsbergensis

3. Produtos para a indústria alimentícia

3. Produtos para a indústria alimentícia

3. Produtos para a indústria alimentícia 3.4. Microrganismos na produção de bebidas alcoólicas destiladas Aquecimento de líquido fermentado com volatilização do álcool = álcool condensado via destilação Qualquer produto fermentado pode ser destilado, gerando produtos distintos: Uisque: destilado de bebidas maltadas Conhaque: destilado de vinho Rum: destilado de melaço Vodca: destilado de grãos ou batata Gim: destilado de grãos de junípero Envelhecimento remove certos compostos da fermentação (sabores indesejados) e confere colorações aos destilados

3. Produtos para a indústria alimentícia 3.5. Microrganismos na produção de vinagre Álcool etílico ácido acético Acetobacter e Gluconobacter A partir de qualquer produto que tenha etanol: vinho, cerveja, arroz, maçã Usado como conservante: carnes, picles, etc. O processo é dependente de O2 Existem vários técnicas: Tonel aberto: vinho exposto ao ar (camada limosa de bactérias na superfície do substrato), pouco eficiente Gotejamento: gotejamento do líquido alcoólico em substratos como madeira Borbulhamento: fermentação submersa com aeração

3. Produtos para a indústria alimentícia

3. Produtos para a indústria alimentícia 3.5. Microrganismos na produção de vinagre Álcool etílico ácido acético Acetobacter e Gluconobacter A partir de qualquer produto que tenha etanol: vinho, cerveja, arroz, maçã Usado como conservante: carnes, picles, etc. O processo é dependente de O2 Existem vários processos: Tonel aberto: vinho exposto ao ar (camada limosa de bactérias na superfície do substrato). Pouco eficiente Gotejamento: gotejamento do liquido alcoólico em substratos como madeira Borbulhamento: fermentação submersa com aeração

3. Produtos para a indústria alimentícia

3. Produtos para a indústria alimentícia 3.6. Cogumelos comestiveis Definição da espécie a ser cultivada Mais cultivados: Agaricus bisporus (champignon de Paris) Lentinus edulus (shiitake) Produção em locais de umidade e temperatura controlados Substratos orgânicos ricos: Agaricus: cama de esterco de cavalo, palha, etc. Shiitake: toras de madeira Produção de spawn

4. Produtos para a indústria 4.1. Microrganismos na produção de etanol 50 bilhões de litros produzidos anualmente Milho, cana-de-açúcar, trigo, beterraba, cavacos de madeira, etc. Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, etc. Solvente industrial e suplemento de gasolina Reduz a emissão de monóxido de carbono e óxidos de nitrogênio Composto energeticamente caro: necessita-se de 25% a mais de E para produzir um litro de etanol do que a energia contida no próprio etanol Celulose a glicose = fermentada a etanol

5. Fermentadores industriais 5.1. Fermentações em larga escala Tamanhos variados: poucos litros até 3 milhões de litros Divididos em: Aeróbios: mais complexos, com equipamentos que garantam a homogeneização e aeração adequadas Anaeróbios: mais simples, somente com necessidade de equipamento para dissipação do calor produzido Fermentadores aeróbios: Necessidade de difusão do oxigênio no líquido Necessidade de controle de pH, concentração de O2, temperatura, massa celular, níveis de nutrientes e concentração do produto Automação do processo

6. Outros produtos industriais Produto Microrganismo Uso Produto Microrganismo Uso Acetona e butanol C. acetobutylicum Solventes, fabricação de e outros clostrídios produtos químicos 2,3-Butanediol Bacillus polymyxa; Solvente, hidratantes, Enterobacter aerogenes intermediários químicos Ácido 2-cetoglucônico Pseudomonas spp. Intermediário na fabri- cação de ácido isoascór- bico (vitamina C) Sorbose Gluconobacter oxydans Fabricação de ácido ascórbico (vitamina C) Ácido cítrico Aspergillus niger Alimentos e bebidas, cosméticos, couro Ácido glucônico Aspergillus niger Alimentos, clarificadores Ácido itacônico Aspergillus terreus Fabricação de resinas acrílicas Ácido fumárico Rhizopus nigricans Fabricação de resinas Bactérias Fungos

7. Produtos ligados a saúde 7.1. Antibióticos 1941 – nenhuma indústria de antibióticos 1951 – 344 milhões de U$D por ano 1980 – 100.000 toneladas com vendas superiores a 1 bilhão de U$D/ano somente nos EUA 2011 – > 20 bilhões de U$D/ano Custo de produção de um antibiótico: 1,2 bilhões de U$D e cerca de 15 anos até a comercialização

Isolamento e seleção de microrganismos produtores de antibióticos

7. Produtos ligados a saúde 7.1. Antibióticos Isolamento das estirpes Testes de eficácia e ausência de toxicidade Seleção das estirpes mais produtivas Modificação genética (algumas vezes necessária) Produção em fermentadores Extração dos compostos antimicrobianos: Utilização de solventes orgânicos para extração Adsorção em superfícies inócuas Precipitação química Purificação Testes continuados para busca de estirpes cada vez mais eficientes

Alguns antibióticos produzidos comercialmente Antibiótico Microrganismo Produtor Bacitracina Bacillus licheniformis (B) Cefalosporina Acremonium sp. (F) Cloranfenicol Síntese química: anteriormente produzido via síntese microbiana por S. venezuelae (A) Cicloheximida Streptomyces griseus (A) Cicloserina Streptomyces orchidaceus (A) Eritromicina Streptomyces erithreus (A) Griseofulvina Penicillium griseofulvin (F) Kanamicina Streptomyces kanamyceticus (A) Neomicina Streptomyces fradiae (A) Nistatina Streptomyces noursei (A) Penicilina Penicillium chrysogenum (F) Polimyxina B Bacillus polimyxa (B) Estreptomicina Streptomyces griseus (A) Tetraciclina Streptomyces rimosus (A)

7. Produtos ligados a saúde 7.2. Enzimas Catalisadores: aceleram atividades bioquímicas Utilizadas como suplementos nutricionais Produzidas por fungos e bactérias Exemplos: Amilases: adesivos, sucos, detergentes Invertases (glicose a frutose): cremes, xaropes (refrigerantes) Proteases: couro, seda, detergentes Pectinases: sucos

7. Produtos ligados a saúde 7.3. Vitaminas e aminoácidos Na indústria farmacêutica Como suplementos nutricionais Na indústria alimentícia 7.3.1. Vitaminas A maioria é produzida quimicamente, mas muitas são muito complexas e portanto produzidas apenas por microrganismos Principais: B12: Sintetizada exclusivamente por microrganismos Essencial a todos os animais Essencial no sangue (hemácias) Não é produzida por plantas (vegetarianos) Propionibacterium e Pseudomonas Riboflavina: bactérias e fungos (Ashbya gossypii)

Vitamina B12 Riboflavina

7. Produtos ligados a saúde 7.3. Vitaminas e aminoácidos Na indústria farmacêutica Como suplementos nutricionais Na indústria alimentícia 7.3.1. Aminoácidos Acido glutâmico: glutamato monossódico – intensificador de sabor produzido por Corynebacterium glutamicum Acido aspártico Fenilalanina aspartame

Fonte: Madigan et al., 2010. Microbiologia de Brock

7. Produtos ligados a saúde 7.4. Esteróides e outras biotransformações Hormônios animais Utilizados como fármacos Corticosteróides: reduzem inflamações, artrites, etc. Estrógenos e androgênicos: usados na fertilidade humana e ganho de massa muscular Cortisona e hidrocortisona: usados no controle de pruridos subcutâneos Podem ser produzidos quimicamente, mas normalmente, pela dificuldade de síntese, tem pelo menos uma etapa microbiana = biotransformação

8. Transformação genética Produtos produzidos por células geneticamente modificadas * área da biotecnologia de maior crescimento 8.1. Insulina humana - 1º biofármaco produzido pela engenharia genética 1982 - produção nos EUA pela Eli Lilly & Co. Microrganismo produtor: Escherichia coli com o gene humano para produção de insulina 8.2. Vacina contra hepatite B (HBV) - 1982 Vírus não cultivável em laboratório Proteína viral HBsAgs (antígeno) Microrganismo: Saccharomyces cerevisiae com o gene para a proteína 8.3. Hormônio do crescimento humano - somatotropina 1982 - E. coli recombinante com o gene

8. Transformação genética 7.4. Vacinas Vacinas de DNA: porções especificas do genoma do patógeno ou genes que codificam proteínas imunogênicas Estes são clonadas em vetor plasmidial ou viral Injeção destes no animal A tradução leva à produção de proteínas de imunoresistência Resposta imune pela proteína codificada Exemplos: Vacina de HIV Vacina de hepatite B Vacina contra cânceres

Bacillus thuringiensis 9. Biocontrole Bacillus thuringiensis

10. Biomineração * Redução das reservas mundiais * Exploração de minérios de baixa qualidade * Poluição causada pelos métodos tradicionais de extração uso de microrganismos mineradores Thiobacillus thioxidans e Thiobacillus ferroxidans ácidos oxidação do minério precipitação

11. Perspectivas na biotecnologia Soja, milho, algodão transgênicos resistentes a insetos e herbicidas Transgenia para aumentar o valor nutritivo de certos alimentos Transgenia para a produção de compostos de interesse farmacêutico: interferon (proteínas de proteção), anticorpos (planticorpos) Vírus do tabaco e tomate modificado contendo proteínas de superfície no controle do plasmódio causador da malária = vacinas comestíveis