IQB201 – Bioquímica Básica I Técnicas de Fracionamento de Aminoácidos Joab Trajano Silva Instituto de Química/UFRJ

Para que Servem as Técnicas de Fracionamento de Aminoácidos? Para determinar os tipos e a abundância de cada aminoácido em um determinado tipo de alimento. Para determinar os tipos e a abundância de cada tipo de aminoácido no plasma sanguíneo, urina ou líquido céfalo-raquidiano. Para determinar os tipos e a abundância de cadas tipo de aminoácido em meteoritos extraterrestres. Para determinar os tipos e a abundância de cada tipo de aminoácido em uma determinada proteína. As técnicas de fracionamento são baseadas nas diferenças de propriedades físico-quimicas existentes entre os aminoácidos.

Técnicas de Fracionamento de Aminoácidos Cromatografia em papel. Nesta técnica, o principal fenômeno responsável pela separação das substâncias é o fenômeno de partição entre duas fases imiscíveis, formadas por uma mistura de um solvente pouco polar e um solvente polar. Cromatografia de Troca Iônica. A cromatografia de troca iônica é um método de fracionamento baseado na fixação de substâncias carregadas a um suporte que contém uma carga oposta. A separação é possível por que as interações eletrostáticas são reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo trocador. Essa afinidade é função do pH do meio, da temperatura, da força iônica do tampão, etc. Eletroforese. Esta técnica é baseada na migração de partículas (moléculas) carregadas, positivamente ou negativamente, quando sujeitas a ação de um campo elétrico. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Sistema moderno de cromatografia que utiliza a injeção das amostras e do solvente em colunas cromatográficas sob alta pressão. Dependendo do tipo de coluna, pode realizar a separação de moléculas utilizando diferentes propriedades físico-químicas (partição, adsorção, troca iônica, etc).

Cromatografia de Partição em Papel Uma grande variedade de técnicas modernas, tanto analíticas quanto preparativa, é denominada de cromatografia. Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia líquida, cromatografia gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel. O que os diferentes tipos de cromatografia possuem em comum é a propriedade de fracionar uma mistura complexa de substâncias com base na diferença de características químicas entre os componentes da mistura. Estas diferenças fazem com que os componentes da mistura interajam de forma diferencial com as fases do sistema cromatográfico, causando a separação dos componentes.

Cromatografia de Partição em Papel O termo coeficiente de partição ou coeficiente de distribuição é normalmente usado para descrever a forma pela qual um composto se distribui entre duas fases imiscíveis. Para a distribuição de um dado composto entre dois solventes, o valor para este coeficiente é uma constante a uma dada temperatura e pode ser definido como:

Uso dos Funis de Separação em Série (Princípio de Partição)

Fase Móvel (Hidrofóbica) Fase Estacionária (Hidrofílica) Fibra de celulose Camada de Solvatação

Separação de um composto com coeficiente de partição = 1.

Os diferentes aminoácidos podem ser separados por cromatografia em papel devido a solubilidade diferencial que apresentam entre a água de hidratação (solvatação) ao redor da das fibras de celulose (fase estacionária) e a fase orgânica móvel que flui por entre as fibras de celulose. A solubilidade relativa dos aminoácidos nestas duas fases pode ser alterada por mudanças na polaridade do solvente, ou no pH da solução, que irá alterar o estado iônico dos aminoácidos. Sob um conjunto controlado de condições, cada componente da mistura irá se deslocar com uma determinada velocidade e, após um período de tempo, estará a uma distância específica do ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente. Este fenômeno pode ser convenientemente expresso como um fator de retardo ou fator de retenção (Rf).

Cromatografia de Troca Iônica A cromatografia de troca iônica é um método de fracionamento baseado na fixação de substâncias carregadas a um suporte que contém uma carga oposta. A separação é possível por que as itnerações eletrostáticas entre os grupos são reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo trocador. Esta afinidade é função do pH do meio, da temperatura, da força iônica do tampão, etc.

  Resina de troca iônica fabricada pela Bio-Rad Laboratories (UNOsphere).

Esfera de Dowex 650C (aumento de 150 X)

Structure of a section of a cation-exchange resin called Dowex 50.

Separação cromatográfica de uma mistura de aminoácidos em uma coluna de troca iônica usando a resina Amberlite IR-120 (similar à Dowex-50) – uma resina trocadora de cátions

Eletroforese A eletroforese é um método de fracionamento baseado na migração de partículas carregadas, positivamente ou negativamente, quando sujeitas à ação de um campo elétrico. Os cátions migrarão para o catodo (pólo negativo) Os ânions migrarão para o anodo (pólo positivo) A velocidade de migração destes íons dependerá do equilíbrio entre a força eletromotriz do campo elétrico (voltagem) e da força retardante (em geral do tipo friccional ou eletrostática) imposta pelo meio em que ocorre a eletroforese. Os suportes comumente usados para a eletroforese são: Papel Acetato de Celulose Amido Agar Poliacrilamida

Eletroforese

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Reações Químicas para Revelação de Aminoácidos Figure Number: 23-13-05P54 Title: End-of-Chapter Problem 54 Caption: UV spectra associated with end-of-chapter Problem 54. Notes: Use the UV spectra of tryptophan, tyrosine, and phenylalanine shown in the figure to calculate the molar absorptivity of each of these amino acids at 280 nm.

Reações Químicas para Revelação de Aminoácidos Os aminoácidos diferem em suas cadeias laterais, que apresentam propriedades características. Estas diferenças podem ser usadas para identificar e quantificar um aminoácido. Reação de ninidrina. Ao reagir com o grupamento amino dos aminoácidos produz um composto de coloração púrpura. A prolina, por possuir um grupamento imino produz um composto de coloração amarela. Reação de Sakaguchi. Usada para a determinação da arginina. O composto resultante da reação tem coloração vermelha. Reação de Pauly. O ácido sulfanílico diazotado (reagente de Pauly) reage com os grupamentos imidazol e fenol da histidina e da tirosina produzindo coloração que varia do laranja ao vermelho. Reagente de Ehrlich. O p-dimetilaminobenzaldeído (em ácido HCL concentrado) reage com o grupamento indol do triptofano produzindo coloração violeta. Reação com Nitroprussiato de Sódio. Este composto reage com o grupamento tiol da cisteína gerando um composto de coloração avermelhada.