Disciplina: Genética II Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Hemoglobinopatias

O que são as hemoglobinopatias ? Distúrbios das hemoglobinas humanas Mutações nos genes das globinas Doença monogênica mais comum Anemia Hereditária

Qual o diagnóstico provável? Caso Clínico 1 • Menino de raça negra, com 4 meses de idade; • Terceiro filho de pais jovens, naturais de Luanda; • O primeiro filho do casal faleceu aos 5 meses; • Aparentemente saudável até 15 dias antes do internamento, com febre e tosse; desde então ficou prostrado e progressivamente mais pálido. Foram realizados diversos exames complementares de diagnóstico, como hemograma com os seguintes resultados: Hemoglobina – 4,6g/dL (13 a 16g/dL) N.º Glóbulos vermelhos – 1.400.000/mm3 (4,5 a 6 milhões) N.º Glóbulos brancos – 8.000/uL (4.000 – 11.000) N.º Plaquetas – 156.000/uL (150.000-450.000) Qual o diagnóstico provável?

Qual tipo de anemia? Ferropriva ou hereditária? Solicitar esfregaço de sangue e eletroforese de hemoglobinas Teste de falcização positivo Esfregaço normal

Estrutura e função FUNÇÃO: transportador de oxigênio em hemácias de vertebrados. ESTRUTURA: tetrâmero  2 cadeias tipo alfa () 2 cadeias tipo beta () Cada subunidade : -cadeia polipeptídica  globina -grupo prostético (cofator): grupo Heme -

Formação da estrutura quaternária da hemoglobina. 4 cadeias são dobradas  tetrâmero globular, com peso molecular de 64.500 D

CARACTERÍSTICAS DA ESTRUTURA DAS GLOBINAS - estrutura bem conservada ao longo da evolução Estrutura terciária: quase todas as globinas possuem as 8 regiões helicoidais  A - H 2 aminoácidos histidina (resíduo F8) conservados fenilalanina (resíduo CD1) sítios internos: resíduos apolares  invólucro hidrofóbico. superfície da molécula: resíduos polares (hidrofílicos) Mutações  conformação/ substituição aa. conservados/alteração do invólucro hidrofóbico  Hemoglobinopatias

CARACTERIZAÇÃO DAS CADEIAS DE GLOBINA Cadeias  e : tamanhos semelhantes cadeia   141aa cadeia   146 aa

Genes das globinas, distribuídos em dois cromossomos.   genes da cadeia : cromossomo 16  ; 2; 1 - genes da cadeia : cromossomo 11  ; G; A; ;   e   diferem em 10 aa

Cluster Beta – LCR (REGIÃO CONTROLADORA DO LOCUS) responsável pela expressão em alto nível do gene da -globina nos tecidos apropriados e durante o desenvolvimento: - controla expressão dos genes da família beta globina: atividade de estimulação, inibição  interação de fatores de transcrição com o DNA e maquinaria da RNA polimerase  Atua como um SUPERACENTUADOR de transcrição - LCR  localizado ~20 kb do gene épsilon  possui 5 sítios hipersensíveis (HS) -deleções da LCR  não expressam os genes do grupo da -globina alvo para terapia gênica.

 G A    LCR Ativação dos Genes Beta Embrionário DNA Fetal DNA Adulto DNA Strachan and Reald HMG2 1999

Como ocorre a ativação e silenciamento dos genes da globina durante o desenvolvimento? http://www.med.yale.edu/obgyn/reproimmuno/courses/class3/sld007.htm

ONTOGÊNIA – Tipos de globinas durante as fases do desenvolvimento http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=dbio&part=A736

Hb Gower 1 Hb Gower 2 HbF HbA2 HbA

Expressão dos genes da globina durante o desenvolvimento  Mudanças temporais da síntese de globina  alterações no local da eritropoiese. SÍNTESE DE GLOBINA EMBRIONÁRIA: - 3a à 8a semanas de gestação: eritropoiese no saco vitelínico  Hb embrionárias  globinas  e  (combinação com as demais) 3 Hb embrionárias Hb Gower 1 (2 2 ) Hb Gower 2 (2 2 ) Hb Portland (2 2 )

Hb F SÍNTESE DA HEMOGLOBINA FETAL 5a semana gestação: hematopoiese muda para o fígado fetal  mudança na síntese de  para  e de  para  Hb fetal 2 2 (Hb F). -predominante (vida fetal) -70% da Hb total ao nascimento, mas na idade adulta  1%. Cadeias : - detectáveis no início da gestação  síntese significativa próximo ao nascimento. Cadeia : -síntese inicia no final da vida fetal, continuando após nascimento, não atinge + de 2% da Hb adulta. Hb F

SÍNTESE DA HEMOGLOBINA ADULTA -hematopoiese: medula óssea -Recém-nascido: HbF (2 2 ): 70-90% HbA (2 2): 0-10% -Após 6 meses de vida: hemoglobinas do adulto HbA (2 2): 95% HbA2 (2 2): 2-3% HbF (2 2 ): até 1%

DOSAGEM GÊNICA E DOENÇAS CLÍNICAS -globina : 4 genes globina : 2 genes -uma única mutação no gene -globina  25% das cadeias  . -mutações da -globina  doença severa na vida fetal e pós-natal. - uma única mutação no gene -globina afeta 50% das cadeias . - mutações da -globina  não trazem consequências pré-natais (globina  e a Hb F). diplóide

DISTÚRBIOS GENÉTICOS DA HEMOGLOBINA A. Variantes estruturais: alteram a globina (mudanças na sequência de aminoácidos), sem afetar a taxa de síntese B. Talassemias: alteração na síntese  desequilíbrio nas quantidades das cadeias do tipo alfa e beta Variantes estruturais: maioria provém de mutações de ponto. - > 900 variantes descritas - anemia hemolítica - transporte de O2 alterado - Brasil: mais comuns Hb S, Hb C e Hb D

HEMOGLOBINAS VARIANTES Hemoglobina S: Hb S (primeira Hb anormal detectada) alteração: 1 aa. dos 146 da -globina 6 Glu  Val (A  T) Mutação em homozigose  Anemia falciforme.

PATOLOGIA MOLECULAR DA HB S Pauling et al. (1949): Hb A e Hb S por eletroforese Ingram (1956): substituição de 1 dos 146 aa. na cadeia da -globina. Ac. Glutâmico: carga negativa Valina: neutro → mobilidade eletroforética mais lenta da HbS

Eletroforese ácida de hemoglobinas em gel de agarose Eletroforese ácida de hemoglobinas em gel de agarose. (1) Hb ASF em sangue de recém-nascido; (2) Hb AS; (3) Hb AA. Devido ao processo físico-químico de eletroendosmose a Hb Fetal migra com maior rapidez que a Hb A. Eletroforese alcalina de hemoglobinas em gel de agarose. Diferenciação da mobilidade eletroforética dos genótipos SC, SF e AS.

DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA - África equatorial: 1/50 nascimentos - Região do Mediterrâneo - Índia e países onde essas pessoas migraram. - incidência: 1/400 a 1/600 afro-americanos. - hemácias: forma afoiçada ( tensão de O2) http://cienciahoje.uol.com.br/114271

AFOIÇAMENTO E SUAS CONSEQUÊNCIAS Hb com subunidades  mutantes condições de  tensão de O2  Hb S agregam-se em polímeros que distorcem o eritrócito (insolubilidade) - são menos flexíveis, não se comprimem nos capilares, obstruindo o fluxo sanguíneo  hipóxia local.

Duas explicações possíveis para a seleção contra homozigotos mutantes: Como explicar a alta frequência do alelo mutante (2S) em algumas regiões da África? Duas explicações possíveis para a seleção contra homozigotos mutantes: 1. Alta taxa mutação ou 2. Heterozigotos portadores mais adaptados certas situações ambientais: heterozigotos portadores (traço falcêmico - HbAS)  maior vantagem seletiva que os homozigotos normais (HbAA).

(HbAS) gene falcêmico : alta frequência em certas regiões da África  heterozigotos são mais resistentes ao Plasmodium vivax (parte do ciclo evolutivo nas hemácias do hospedeiro)

http://www.assis.unesp.br/~egalhard/errmetab.htm

MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS destruição prematura dos eritrócitos afoiçados anemia nos dois primeiros anos, atraso crescimento e atraso da puberdade, esplenomegalia, infecções repetidas (hipofunção esplênica), infartos nos tecidos (ulceração) problemas osteoarticulares e renais http://www.ufv.br/dbg/BIO240/DG112.htm

HEMOGLOBINA C - HbC substituição na 6a posição da cadeia  (GAG  AAG): 6 Glu  Lys - menos solúvel que a Hb A  cristaliza-se nas hemácias  distúrbio hemolítico leve. - anemia sob estresse ou durante a gravidez gene C frequente na África ocidental e em descendentes dessa região. Hb SC: indivíduos possuem alelo S no outro locus da -globina. distúrbio hemolítico mais leve que a anemia falciforme

mutação de ponto  substituição na cadeia 42 Phe  Ser HEMOGLOBINA INSTÁVEL HB HAMMERSMITH mutação de ponto  substituição na cadeia 42 Phe  Ser fenilalanina  resíduo CD1 - aa conservados (alojar o Heme) -resíduo de serina é menor  Heme sai do lugar  - instabilidade ( hemoglobina precipita formando inclusões) - afinidade por O2  cianose. http://www.ciencianews.com.br/hemoglobinopatias/hemoglobinopatias-index.htm

HEMOGLOBINAS COM ALTERAÇÕES FUNCIONAIS TRANSPORTE DE O2 ALTERADO -mutações que alteram a capacidade da Hb transportar O2 Metemoglobinas – Hb M Oxihemoglobina: forma normal da Hb em que o ferro está no estado reduzido (ferroso) Metemoglobina: o ferro encontra-se na forma férrica (oxidada)  incapaz de transportar O2  cianose; assintomática nos heterozigotos. - Ex.: Hb Hyde Park - 92 His  Tyr - histidina: aa conservado (resíduo F8) http://www.hemoglobinopatias.com.br/hemoglobinopatias/listagem.htm

Hb Lepore - alguns pacientes com fenótipo de -talassemia: - cadeias globínicas híbridas : metade N-terminal de uma cadeia  fundida com a metade C-terminal de uma cadeia  normal - Fusão da porção 5’ do gene  com 3’ do gene  pareamento desigual na MEIOSE crossing-over homólogo (genes homólogos)

Hb Lepore: cadeias  fusionadas. Pareamento normal Pareamento anormal Crossing-over desigual Anti-Lepore Lepore Hb Lepore: cadeias  fusionadas.

- mutação provoca redução ou ausência na síntese de uma das cadeias  ou , sem alterar a sequência de aminoácidos - cadeia produzida na taxa normal: excesso relativo  precipitação na célula  lesando a membrana  destruição prematura da hemácia. TALASSEMIAS 2 grupos  talassemias  talassemias Distribuição geográfica ao redor do Velho mundo: Mediterrâneo, Oriente Médio e partes da África, Índia e Ásia. Thalassa: mar

Recombinação homóloga desigual ALFA-TALASSEMIAS distúrbios genéticos na produção da -globina afetam a formação das Hb fetal (HbF 2 2 ) e adulta (HbA 2 2) Ausência de cadeia : talassemia 0 Redução de cadeia : talassemia + - ausência de cadeias de -globina: cadeias de -globina formam um tetrâmero. maioria das -talassemias  deleções Recombinação homóloga desigual

Formas de Talassemia Alfa Deleção 4 genes alfa: formação de 4  Hb Barts  forma major  hidropisia fetal Deleção de 3 genes alfa: tetrâmero 4  Doença da Hb H  precipitam na hemácia  destruição e anemia hemolítica Deleção de 2 genes alfa: anemia leve (traço talassêmico) Deleção de 1 gene alfa: portador silencioso

- estado heterozigoto (2 genes  normais e 2 mutantes). - -talassemia por deleção homozigota (ausência de cadeias ) restrita ao SE asiático. - estado heterozigoto (2 genes  normais e 2 mutantes). 2 genótipos —/ — — —/  progênie — —/— — Hidropisia fetal Pais Hidropisia Fetal

DOENÇA DA HB H Precipitados da HbH Doença da Hb H (4): deleção de 3 genes (_ _/ _ ) moderadamente grave. alteracões ósseas, esplenomegalia afeta orientais e brancos Pais Hemoglobina H Traço -talassêmico: deleção de 2 genes (_ _/  ) : - anemia leve. - comum em orientais e SE asiático Precipitados da HbH

SO Ásia, negros americanos e brasileiros TRAÇO ALFA-TALASSÊMICO Traço -talassêmico (_/_ ) SO Ásia, negros americanos e brasileiros Pais descendentes

DESEQUILÍBRIOS DAS GOBINAS ALFA (4) (4) http://www.ciencianews.com.br/doencaeritro/Altera%E7%F5es%20Eritr.%20Nas%20Talassemias%20-%207/genfisioa.htm

Ausência de cadeia  : talassemia 0 BETA-TALASSEMIAS produção reduzida ou ausente de -globina  anemia microcítica hipocrômica. Ausência de cadeia  : talassemia 0 Redução de cadeia : talassemia + desequilíbrio da síntese de -globinas  precipitação das cadeias   danos na hemácia. - cadeia  é importante no período pós-natal  síntese após o nascimento (-globina substituiria a  e a síntese de Hb A é  ). - maioria das -talassemias são decorrentes de mutações pontuais síntese de RNA - síntese de Hb F reduz a gravidade da doença. indivíduos homozigotos para -talassemia  talassemia major indivíduos heterozigotos para -talassemia  talassemia minor http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm

1. Mutação nos promotores (TATA box) 2. Mutação no splicing do mRNA 3. Mutação da cobertura (cap) do mRNA 4. Mutações sem sentido e de matriz de leitura

Normal Hipocrômica e microcítica

DESEQUILÍBRIOS DAS GOBINAS BETA                                                                                                                                                                                   Figura 7.13: Relação entre quantidade de globinas alfa livre, níveis de Hb A, Hb A2 e Hb Fetal, e gravidade do quadro clínico em pacientes com talassemia beta menor e maior.                                                                                                                                                                                   Figura 7.13: Relação entre quantidade de globinas alfa livre, níveis de Hb A, Hb A2 e Hb Fetal, e gravidade do quadro clínico em pacientes com talassemia beta menor e maior.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                     DESEQUILÍBRIOS DAS GOBINAS BETA http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm

TIPOS DE TALASSEMIA BETA http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm

-anemia intensa antes dos 2 anos (Hb F pós-natal), TALASSEMIA MAJOR – ANEMIA DE COOLEY Sinais Clínicos -anemia intensa antes dos 2 anos (Hb F pós-natal), -atraso do crescimento, -icterícia, -hepatoesplenomegalia, -alterações esqueléticas (expansão da medula óssea). Tratamento - transfusão sanguínea - administração de agentes quelantes do ferro transplante de medula óssea Terapia gênica

TALASSEMIA MAJOR – ANEMIA DE COOLEY Eletroforese de hemoglobinas em gel de agarose alcalina: (1) Hb AF de talassemia beta maior; (2) Hb S/beta talassemia ou SF, onde m indica o fracionamento da metaemoglobina S e a a globina alfa livre; (3) Hb AA2 e Fetal em tal. beta menor; (4) Hb AS (traço falciforme); (5) Hb AA (normal).

Cadeias  normais em excesso precipitam-se formando os corpúsculos de Heinz na hemácia em forma de lágrima.

TALASSEMIA MINOR -TRAÇO TALASSÊMICO portadores de um alelo mutante (heterozigoto) Geralmente assintomáticos - anemia leve diagnóstico: eletroforese ( Hb A2).

Risco para casamentos entre portadores de talassemia beta

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Eletroforese em acetato de celulose (pH alcalino ou ácido): rápida e baixo custo, mas sensibilidade limitada  Hbs co-migram na mesma posição.

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                       DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Eletroforese de Focalização isoelétrica: técnica de alta precisão  identifica Hbs com co-migração A Hb migra no gel e se precipita ao encontrar seu ponto isoelétrico (conforme o pH no gradiente do gel)

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL HPLC (Cromatografia líquida de alta pressão): diagnóstico diferencial das hemoglobinopatias (dados quantitativos e qualitativos) Técnicas moleculares: identificação da mutação (PCR, sequenciamento)

5- Considerando que a amostra número 1 é o perfil adulto normal (HbAA) responda quais são os perfis das amostras 2 e 3 nas eletroforeses A e B. Eletroforese A Eletroforese B - + A F S e similares A2; C e similares 1 2 3 - + A F S e similares A2; C e similares 1 2 3