Profa. Gláucia Maria Pastore Proteases TA 502 - 2005 Profa. Gláucia Maria Pastore Laboratório de Bioaromas e Profa. Gabriela Macedo Laboratório de Bioquímica de Alimentos 10 de Novembro de 2005

Proteases: Definição Definição: Proteases catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas. E.C: Classe 3 das hidrolases, e subclasse 3.4, das peptídeo-hidrolases ou peptidases.

Classificação das proteases: FONTE: vegetais, animais ou microbianas Presentes no alimento Excretadas por microrganismos presentes nos alimentos Adicionadas como coadjuvantes de processo AÇÃO DO SÍTIO CATALÍTICO: Endopeptidases ou Exopeptidases Proteólise Limitada ou Ilimitada NATUREZA DO SÍTIO CATALÍTICO: Serina Cisteína Metaloproteases Aspartico proteases

Classificação das proteases (Hartley)

Proteases: Tipos catálise   1) Proteólise limitada: a protease cliva somente uma ou um número limitado de ligações peptídicas: uma proteína alvo para ativação como a conversão de prohormônios em hormônios. 2) Proteólise Ilimitada: quando as proteínas são degradadas em amino ácidos e seus constituintes

Aplicações Tradicionais de proteases vegetais e animais

Outras aplicações das Proteases Detergentes Couros: substituição produtos do processo que são poluentes Produtos farmacêuticos: pomadas cicatrizantes, auxiliares digestivos Alimentos: amaciamento de carnes Reação de plasteína Solubilização de proteínas

Proteases Sulfidrílicas ATIVIDADE DEPENDE DE UM OU MAIS GRUPOS SULFIDRILAS -SH NO SÍTIO ATIVO Ativadas por agentes redutores: cisteína Inativadas por oxidantes, íons metálicos PROTEASES VEGETAIS: bromelina, ficina e papaina PROTEASES MICROBINAS ALGUMAS Papaia: Látex do mamão papaya (Carica papaya) frações : papaína e chimopapaina Bromelina: Extração do caule da planta Ficina: Látex de figos verdes, maduro tem 125 menos atividade.

Mecanismo cisteína-protease

Inativação das proteases sulfidrílicas SH : oxidado, enzima inativa Atividade inativada por agentes oxidantes tais como Oxigênio. Atividade pode ser recuperada por agentes redutores: cisteína.

Proteases vegetais: Cisteína Proteases Esta família inclui as proteases vegetais tais como papaína, bromelina, ficina e também as catepsinas lisossomais de mamíferos e microbianas. São enzimas sulfidrílicas e apresentam SH no sítio ativo. Papaína é a mais estudada possui Cys 25 e His 159 no sítio ativo e a reação ocorre como nas serinas: em duas etapas. pH neutro, dependente do substrato.

Características proteases vegetais

Síntese de Plasteínas Plasteínas são polipeptídeos obtidos por síntese utilizando-se a capacidade da papaína de polimerizar amac. Hidrolisado de soja def.metionina + ésteres de metionina Papaína Plastéina metionina incorporada ao hidrolisado

Proteases na clarificação de cervejas Turvação da cerveja a baixa temperatura pode ter 2 causa basicamente: 1. Contaminação microbiana 2. Complexação de polipeptídeos e taninos quando a cerveja é resfriada. Taninos são compostos fenólicos presentes no lúpulo que contribuem para o sabor amargo e adstringência do produto. A utilização de papaína a fim de diminuir as cadeias de proteínas presentes e evitar a complexação com taninos é prática comum em algumas cervejarias.

Produção de queijo azul: blue cheese Renina animal e microbiana. 1874 Christian Hansen Economicamente mais importante na indústria de alimentos O papel do Penicillium roqueforti na produção do blue cheese está associado com a proteólise durante a maturação do queijo. Penicillium roqueforti: Endopeptidase e Exopeptidase Apesar da proteólise extensiva no blue cheese (baseada na grande quantidade de nitrogênio solubilizado) a textura e coesão ainda é retida.

Adição de enzimas para acelerar a maturação de queijos

Constituintes do leite: K- caseina Propriedade especial: é única fração da caseína do leite solúvel na presença de íons Cálcio. Efeito estabilizante: estabiliza as frações da caseína em solução, pela formação de micélios coloidais.

Hidrólise da kapa caseína O micélio coloidal formado pela kapa caseínatem PM 10000 e 100 nm. Partes hidrofílicas para fora do micélio. Partes hidrofóbicas: alfa s1 e s2 caseina para dentro. A kapa caseína é mais facilmente hidrolisada pois está na superfície da micela. A hidrólise da kapa caseína desestabiliza o micéliocausando a coagulação do leite. A hidrólise específica entre fenilalanina-metionina da k caseina pela renina, libera um peptídeo com carga altamente negativa,que se coagula na presença do Calcio. Renina K caseína p-k caseína + glicolipídeo Cálcio Coagulação

Renina (quimosina ou coalho animal) Fonte: Abomasso (4O estômago do bezerro, cordeiro, cabrito)

Obtenção da renina Coalho

Pepsina Pepsina-protease ácida é extraída de estômago de suínos. Aplicações: Nas preparações de renina como contaminante ou substituto de renina; Auxiliar da digestão Preparações de cereais e alimentos infantis Propriedades: pH ótimo: 1,0 - 4,0 pH estabilidade máxima: 5,0 - 5,5 Especificidade: relativamente ampla hidrolisando principalmente ligações peptídicas entre amac aromáticos.

ATIVIDADE DEPENDE DO GRUPO ÍON METÁLICO Metaloproteases ATIVIDADE DEPENDE DO GRUPO ÍON METÁLICO SÍTIO ATIVO: Mg; Zn; Co, Fe, Hg, Cad, Cu, Ni O metal pode estar fortemente ligado e dificilmente ser removido ou estar fracamente ligado e ser removido por diálise contra EDTA. A remoção do íon inativa a enzima. São classificadas em exo e endo peptidases

Proteases: Endo e Exo peptidases Endopeptidases : atuam nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as regiões N e C terminal. Exopeptidases: Atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido Aminopeptidases. As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido Carboxipeptidases.

Carboxipeptidase A AmAc amargos Remove aa do terminal carboxilia e favorece a liberação de aa com cadeias laterais aromáticas: Leucina Isoleucina Não hidrolisa substratos aa terminal: Arginina Lisina Prolina, É adequada para remoção do sabor amargo em hidrolisados proteicos: O sabor amargo é devido ao aparecimento de peptídeos que apresentam aa hidrofóbicos no terminal carboxílico: Leucina Prolina Valina Fenilalanina AmAc amargos

Peptídeos com cadeias laterais hidrofóbicas: SABOR AMARGO Carboxipeptidases A - exopeptidase ou Aminopeptidase Sabor amargo desaparece

Serinas proteases Serina no sítio ativo Tripsina, Quimitripsina, Elastase, Subtilisina Endoproteases Alcalinas pH 7,0 - 11,0 Inibidas por DFP (diisopropil fluorofosfato)

Tripsina Tripsina é extraída do pâncreas de suínos e bovinos. Serina protease. Produção de hidrolisado protéico: Aplicação. pH ótimo: 7- 9 Temperatura ótima: 50oC Especificidade: Mais específica para as ligações peptídicas envolvendo grupos carboxilas dos aa básicos: Lisina e Arginina. Tripsina é muito estudada é muito estudada devido às suas propriedades de ativação de outras proteases. E também porque alguns alimentos possuem inibidores desta enzima.

Tripsina Tripsinogênio Inativo Tripsina Tripsina Quimotripsinogenio Quimotripsina ativa Carboxipeptidase Procarbosipeptidase A inativa

Proteases em panificação As propriedades reológicas da massa de farinha de trigo são devidas às proteínas do Glúten. Glúten: responsável pela força da farinha e viscoelasticidade. A força está ligada à capacidade de reter gás durante a fermentação do pão. Rede de gluten. Agentes oxidantes: Bromato Peróxido melhoram a farinha Iodato Redutores: pioram a farinha: cisteína e glutation

Proteases em panificação: Proteases fúngicas de Asp. Oryzae são misturas de exo e endo peptidases. Rompem a rede do Glúten por hidrólise das ligações peptídicas diminuindo elasticidade e viscosidade da massa. Reduzem o tempo de mistura. Vantagens: elasticidade e textura melhores retenção de gás maior Melhor simetria Aroma tempo de estocagem maior.

Agradecemos à todos pela Atenção ... Proteases TA 502 - 2005 Profa. Gláucia Maria Pastore Laboratório de Bioaromas e Profa. Gabriela Macedo Laboratório de Bioquímica de Alimentos 10 de Novembro de 2005 Agradecemos à todos pela Atenção ...