PRODUÇÃO DE ESTERÓIDES Vários esteróides são essenciais para os processos biológicos. Ex: Ácidos biliares, hormônios sexuais Ocorrem reações enzimáticas de esteróides Biotransformaçãoé um processo biológico pelo qual um composto orgânico é modificado para um produto recuperável, mediante reações simples, quimicamente definidas, catalisadas por enzimas celulares. Esteróides animais  colesterol Esteróides vegetais  sitosterol, estigmasterol, campesterol Esteróide microbiano  ergosterol

Características dos microrganismos para produção de esteróides Alta relação superfície - volume Crescimento rápido Alta velocidade do metabolismo Eficiente transformação dos substratos Ter uma grande variedade de enzimas Diferentes microrganismos atuam sobre o mesmo esteróide produzindo transformações de diferentes tipos.

QUANDO A BIOTRANSFORMAÇÃO É PREFERIDA: Quando o processo requer uma alta especificidade para atacar um sítio específico. Preparar um único isômero do produto São realizadas à temperatura ambiente Pressão ambiente São realizadas em meio aquoso

1937, Manole: levedura podia oxidar uma hidroxila nuclear Os microrganismos são utilizados como reativos químicos para a preparação de intermediários chaves necessários em síntese orgânica ou para a produção econômica de produtos finais. Os microrganismos servem como fontes de enzimas para uso em sistemas analíticos e as transformações microbianas exercem um papel importante nos estudos do metabolismo que deve acompanhar as avaliações clínicas da droga

Necessidade da biotransformação Síntese de esteróides  baseia-se na introdução de um oxigênio no carbono 11 da molécula de esteróide. Hormônios adrenocorticóides Corticosterona Cortisoma Hidrocortisona e seus derivados terapêuticos: prednisona, predsolona e triamcinolona Progesterona

HISTÓRICO 1949  Administração de cortisona podia aliviar a dor em pacientes como artrite reumatóide  a cortisona era obtida a partir de supra-renais bovinas e sua síntese a partir do ácido desoxicólico. 1952  Peterson, descreveu a 11 - hidroxilação da progesterona utilizando Rhizopus arrhizus  os corticóides, os contraceptivose, o diurético espirolactona. A biotransformação de esteróides é somente a segunda depois da produção de antibióticos como contribuição vital dos microrganismos à produção de produtos farmacêuticos.

Substratos para a síntese de hormônios esteroidais e seus derivados Colesterol, estigmasterol, -sitosterol, ácido desoxicólico, diosgenina  são os substratos preferidos devido a abundância na natureza e pela sua facilidade de transformação em intermediários essenciais. Estigmasterol  progesterona Diosgenina  andrógenos, estrógenos e progesterona -sitosterol e Campesterol  androstenediona e androstadienediona, que são intermediários chaves.

Principais biotransformações de importância econômica Hidroxilação Desidrogenação Oxidação à cetonas Aromatização do anel A sem degradação Degradação do núcleo dos esteróides Oxidação de álcoois à cetonas Corte da cadeia lateral Oxidação do enxofre à sulfóxido amina ou cetona

Rotas sintéticas para obtenção de esteróides clinicamente importantes Estigmasterol  Progesterona  11hidroxiprogesterona  hidroxicortisona + cortisona  prednisolona e prednisona 1  Conversão química 2  Rhizopus nigricans 3  Modificação química 4  desidrogenação em C1 por Septomyxia affins * Proporciona 4 a 10 vezes mais atividade antiinflamatória que a cortisona

Tecnologia da biotransformação Microrganismos  Fungos filamentosos, Actinomicetos e Bactérias. Os microrganismos devem ser específicos para realizar a transformação desejada, sem ao mesmo tempo atacar as outras porções da molécula do esteróide, causando acúmulo do produto secundário e diminuindo o rendimento.

Seleção e manutenção do microrganismo Vezina, 1969  Para selecionar microrganimos que possam aromatizar esteróides. Os esteróides reagem especificamente com fluorborato de diazo p-nitrobenzeno para produzir uma coloração roxa. As colônias crescendo em um meio sólido, que contém esteróide adequado como substrato, replicam-se antes que o reativo seja vaporizado. Um anel roxo desenvolve-se ao redor das colônias ativas. Substratos esteróide incorporado como única fonte de carbono em um meio mineral de solo, as células que podem degradar o substrato crescem e serão transferidas para o mesmo meio enriquecidas com outra fonte de carbono

Mecanismo de ação Parece tratar-se de uma reação destoxificante e tais transformações seriam realizadas para neutralizar a toxicidade de determinadas substâncias As enzimas são produzidas de acordo com a composição do meio em que o microrganismo está colocado. As enzimas em sua maioria são do tipo adaptativa /indutiva, ou seja, enzimas que somente são sintetizadas quando em resposta à presença de certos substratos

Processo de fabricação FERMENTAÇÃO DIRETA O substrato a ser transformado é adicionado ao meio de cultura. Células vegetativas + meio adequado Agitação, meio, temperatura, pH, solvente, substrato Adiciona-se esteróide até a fase de crescimento Tomam-se amostras em intervalos de tempo Analisam-se por TLC, cromatografia em papel, gasosa ou HPLC Determina-se a estrutura dos produtos formados

INDUSTRIALMENTE Desenvolve-se o inóculo Fermentador  aço inox, aerados e com agitação Microrganismo cresce de 17-48 horas até uma concentração desejada de células ativas. Temperatura de 27-37 ºC Após crescimento do microrganismo adiciona-se o substrato (1-20g/L) e permite que prossiga a transformação. Os esteróides são insolúveis ou levemente solúveis em água Dissolve-se o substrato em um solvente miscível em água: metanol, etanol, propileno glicol, acetona... Adiciona-se a solução em pequenas quantidades para minimizar a toxicidade causada por uma grande quantidade de solvente de uma vez

Terminada a transformação... Filtra-se o meio de cultura Separa-se o micélio A extração do produto é feita com solvente imiscível em água (cloreto de etila, clorofórmio, acetato de etila) Evapora-se o solvente O esteróide é separado como pó ou no estado oleoso. Purificação do esteróide em cromatografia em coluna

PROCESSO DE FERMENTAÇÃO DUPLA Crescimento do microrganismo Meio mais rico Após crescimento ótimo- Filtração ou Centrifugação Lavagem para retirar nutrientes Microrganismo em suspensão. Adição de esteróide dissolvido em solvente Transformação - agitação , aeração, 30 ºC Remove-se a cultura por filtração O filtrado é extraído com clorofórmio Recuperação do esteróide

APLICAÇÕES Hormônios da supra-renal: Cortisona, regulador do metabolismo eletrolítico Hidrocortisona: Profilaxia e tratamento do choque cirúrgico Prednisolona Tratamento da artrite reumatóide Moléstia cultânea - lupus eritematoso Doenças alérgicas - asma brônquica Moléstias inflamatórias oculares

APLICAÇÕES Estrógenos : Menopausa, dismenorréia, acne, colesterolemia, prevenção de crises cardíacas, osteoporose. Progestógenos: Controle da menstruação, contraceptivos orais. Andrógenos: Deficiências testiculares, anemia refratária, fatores de crescimento, anabólicos.