O DNA recombinante Marcelo Menossi UNICAMP Marcelo Menossi Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética Departamento de Genética e Evolução – IB UNICAMP http://cafe.cbmeg.unicamp.br/biotecmol/aula4_dna_rec.pdf

Problema: Como produzir hormônio de crescimento humano em milho ? 17:40 - 18:30 CB-13

DNA recombinante Herbert W. Boyer Stanley Cohen USFC 17:40 - 18:30 CB-13 Herbert W. Boyer USFC Stanley Cohen Stanford University

Questões iniciais 0. O laboratório tem Certificado de Qualidade em Biossegurança? Obedecer a legislação brasileira ! 1. Qual é o produto? Planta transgênica de milho que produza hormônio de crescimento 2. Alguém já fez isso? Busca em revistas científicas e banco de patentes 3. Viabilidade econômica, custos de produção, mercado, etc... Entenda a importância do assunto e consulte especialistas 4. Como montar o gene recombinante? - como obter a região codificante? - em qual parte da planta será expresso? - sistema de purificação? - biossegurança?

DNA organismo células núcleo cromossomos DNA

Dogma central da biologia molecular Animação: Carnegie Mellon

Dogma central da biologia molecular DNA: Armazena informação RNA: intermediário da informação do DNA Proteína: Realiza as tarefas das células

O gene promotor codificante terminadora ...ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC... Onde: folha raiz Quando: início germinação ataque inseto Quanto: muito, pouco. O que: proteína bactericida absorção de Fe síntese açúcar Final do gene

DNA recombinante ou transgene Promotor hGH Terminador Para obter uma planta transgênica que acumule hormônio de crescimento humano em sementes, como seria montado o cassete de expressão? 4. Como montar o gene recombinante? - como obter a região codificante? - em qual parte da planta será expresso? - sistema de purificação? - biossegurança?

Como obter a região codificante ? Alternativa menos complexa: busque em banco de dados. NCBI: milhões de seqüências de DNA e proteínas 62 36 617 55 67 171 1008 genomas !

Seqüência codificante (CDS) Hormônio crescimento humano

CDS: homônio crescimento humano O ATG iniciador e o TAG de parada estão indicados em vermelho. Eles delimitam a CDS.

Transcrição AUG STOP Transcrito primário RNA mensageiro Região codificadora Região terminadora Promotor Exon Intron Líder (transcrito, não taduzido) Fatores de transcrição Em alguns tecidos ocorre ligação de fatores de transcrição, que ativam a RNA pol II RNA pol II Na transcrição a RNA pol II produz o transcrito primário do RNA Transcrito primário No processamento o transcrito primário é modificado por enzimas, que removem os introns, adicionam o cap na extremidade 5’ e a cauda poli-A na extremidade 3’ AUG STOP AAAAAAA(n) RNA mensageiro Na tradução, o mRNA é “lido” pelos ribossomos, iniciando a produção da proteína no AUG e terminando em um códon de parada (STOP)

Projeto Genoma EST: obtenção de cDNA 2- Produção de cDNA 1- Extração RNA Transcrição mRNA Diversos tipos celulares Flor, raiz, colmo... cDNA

Como separar os cDNAs dos distintos genes? Solução aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 1.5 ml

Plasmídeos Pequenos cromossomos circulares de bactérias

Vetores plasmidiais Gene de interesse Cromossomos circulares, fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular. Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb Insertos de até 10 kb Têm origem de replicação, gene de resistência a antibiótico e sítio múltiplo de clonagem (vários sítios de enzimas de restrição) Várias cópias por célula Bactéria contendo um plasmídeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em solução com 15% glicerol DNA plasmidial é facilmente isolado de culturas celulares.

Sítio múltiplo de clonagem Enzima 1 Gene de interesse Enzima 2

A ligação pode ocorrer entre DNA distintos Extremidades coesivas

Extremidades abruptas (blunt ends)

DNA ligases: reparam DNA quebrado

Como ligar extremidades não compatíveis? Klenow fragment: atividade DNA polymerase 5’ -> 3’ e exonuclease 3' -> 5' Preenchimento extremidades 5' de DNA Digestão de extremidades 3' de DNA T4 DNA polimerase é 200 x mais ativa para este fim

Como separar os cDNAs dos distintos genes? Solução aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 1.5 ml

Clonagem do GOI no vetor de expressão morpheus.fmrp.usp.br/td/files/apostilaTD_2003.doc

gene resistência antibiótico Clonagem dos cDNAs + gene resistência antibiótico Plasmídeo bacteriano "aberto" cDNA (ESTs) Enzima T4 DNA ligase Coleção de cDNAs clonados.

Transformação de bactérias ampR + Eletroporação Bactéria Biblioteca de cDNA Este e o próximo slide foram inseridos para detalhar a transformação de bactérias com os plasmídeos contendo os ESTs. *não* mostrados em aula

Seleção das bactérias com plasmídeos Biblioteca de cDNA Incubação a 37ºC para a síntese de b-lactamase pelo gene ampR Plaqueamento em meio com agente seletivo Formação de colônias contendo plasmídeos

Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA

Inferência da função da proteína Tradução das 6 possíveis frames e comparação com proteínas depositadas em bancos de dados >SCCCLR1076G12.g CCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTT GCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG Algoritmo Blastx >SCCCRT2001A02.g CGCTCCGCATCCCCCACTCCGGCTACCATCTCCTCTCCCCCGCCGCCTTCTCCATCGGAG CTCCCTACCGAGTGCCCCGAACCATGGCGGCTGCATCAGCCACCCGCCGCGGCCTCTCCG CGCTCCTCCTCTCCTCCTCCCGCGCGCTCCCCCGCCGCCTGGCCCCCCTCGCCGCCGCGG CTGCCTCGGCCCACGTCGCCCCGTGGGCCCTCCTCGTGTCGCGCGGGGCCAGGACCGCGT CGTCCGGCGGGTCCGGGTACTCGCCGCTGAACGACCCGTCCCCGAACTGGAGCAACCGCC CGCCCAAGGAGACGATCCTTCTCGACGGCTGTGACTACGAGCACTGGCTCATCGTCATGG AGTTCCCCACCGACCCCAAGCCCTCCGAGGAGGAGATGGTCGCGGCCTACGTCAAGACCC TCGCGGCCGTCCTCGGAAGTAAGGAGGAAGCAAAGAAGAAAATCTACTCAGTGTGCACTT CAACATACACAGGGTTTGGTGCATTGATTTCAGAGGAGTTATCATACAAAGTTAAAGGAT TGCCGGGAGTTCTTTGGGTTTTACCTGATTCATATCTGGATGTTCCTAACAAGGACTACG GAGGTGATCTATTTGTAGATGGCAAGGTCATACACAGACCTCAGTTCCGATTCAATGAGA GACAGCAGGTAAGGAGTAAGCCTCGTCCTCGCTACGACAGACGACGTGAGATTGTCCAAG TGGAGCGGAGAGAAACAATGCAAAGAAGCCCTTCGACACAGCAGCAGAGGCTGCCATTTC CACGGGAGGCTACACAGAATCAAGAGCAGCACTGAAACCATG

Biblioteca de cDNA Delimitar os tecidos que cujos transcritomas serão amostrados Sangue, cérebro, fígado, etc Extrair RNA Gerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversa Clonar em plasmídeos Transferir para bactéria (normalmente E. coli) Amplificar o DNA plasmidial Seqüenciar Avaliar similaridade da proteína deduzida com bancos de dados Organizar informações do genoma em banco de dados >SCCCRT2001A02.g CGCTCCGCATCCCCCACTCCGGCTACCATCTCCTCTCCCCCGCCGCCTTCTCCATCGGAG CTCCCTACCGAGTGCCCCGAACCATGGCGGCTGCATCAGCCACCCGCCGCGGCCTCTCCG CGCTCCTCCTCTCCTCCTCCCGCGCGCTCCCCCGCCGCCTGGCCCCCCTCGCCGCCGCGG CTGCCTCGGCCCACGTCGCCCCGTGGGCCCTCCTCGTGTCGCGCGGGGCCAGGACCGCGT CGTCCGGCGGGTCCGGGTACTCGCCGCTGAACGACCCGTCCCCGAACTGGAGCAACCGCC CGCCCAAGGAGACGATCCTTCTCGACGGCTGTGACTACGAGCACTGGCTCATCGTCATGG AGTTCCCCACCGACCCCAAGCCCTCCGAGGAGGAGATGGTCGCGGCCTACGTCAAGACCC TCGCGGCCGTCCTCGGAAGTAAGGAGGAAGCAAAGAAGAAAATCTACTCAGTGTGCACTT CAACATACACAGGGTTTGGTGCATTGATTTCAGAGGAGTTATCATACAAAGTTAAAGGAT TGCCGGGAGTTCTTTGGGTTTTACCTGATTCATATCTGGATGTTCCTAACAAGGACTACG GAGGTGATCTATTTGTAGATGGCAAGGTCATACACAGACCTCAGTTCCGATTCAATGAGA GACAGCAGGTAAGGAGTAAGCCTCGTCCTCGCTACGACAGACGACGTGAGATTGTCCAAG TGGAGCGGAGAGAAACAATGCAAAGAAGCCCTTCGACACAGCAGCAGAGGCTGCCATTTC CACGGGAGGCTACACAGAATCAAGAGCAGCACTGAAACCATG

Primer para síntese de cDNA (Not I adapter): 5’ GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3’ AUG STOP mRNA AAAAAAAAAAAAAAA 3’ TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCG...CAG 5’ Síntese primeria fita de DNA com transcritase reversa mRNA AAAAAAAAAAAAAAA cDNA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCG...CAG 5’ Síntese segunda fita de DNA com RNAse H, DNA polimerase e Ligase AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCG...CAG 5’ Ligação do Adaptador Sal I TCGACCCACGCGTCCG AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC GGGTGCGCAGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCG...CAG 5’ Digestão com Not I TCGACCCACGCGTCCG AAAAAAAAAAAAAAAGGGC GGGTGCGCAGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG 5’ TCGA ATG STOP AAAA 3’ 3’ TAC STOP TTTT CCGG 5’

Vetores plasmidiais Gene de interesse

pSC101: primeiro plasmídeo Stanley Cohen Herbert Boyer 17:40 - 18:30 CB-13 Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro. (1973) COHEN SN, CHANG ACY, BOYER HW, HELLING RB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 70:3240-3244

Problema: produção de hormônio de crescimento humano em milho Identificar o gene de humanos que codifica o hormônio de crescimento Montar um cassete de expressão que seja ativo em milho Produzir grandes quantidades do DNA Obter uma planta transgênica Purificar a proteína 17:40 - 18:30 CB-13

Plasmídeo com o gene do hGH em mãos gene resistência antibiótico

CDS: homônio crescimento humano O ATG iniciador e o TAG de parada estão indicados em vermelho. Eles delimitam a CDS.

Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo ?

A Semente de Milho Fonte: Adilson Leite

Composição das sementes: No milho as sementes representam cerca de 40% da massa da planta. Composição das sementes: 10% de proteína 60-80% de amido 4%de óleo Fonte: Adilson Leite

Construção do gene quimérico promotor codificante terminadora ...ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC... Onde: endosperma Quando: desenvolvimento da semente Quanto: muito O que: hGH Final do gene

Buscar em publicações promotores com padrão desejado Como clonar o promotor? Buscar em publicações promotores com padrão desejado Ou B. Clonar um novo promotor: Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado Clonar o promotor: Busca em banco de dados Genome walking Screening de bibliotecas genômicas

Bibliotecas genômicas Vetores especiais: Cosmídeos: 30-46 kb de inserto Cromossomos artificais de bactéria (BACs): até 300 kb

Detecção de ácidos nucléicos – Southern blot Gene é marcado com radioatividade 32P T C A G DNA do BAC B ligado na membrana de náilon DNA do BAC A ligado na membrana de náilon

Detecção do sinal radioativo G W M BACs que acendem: tem o gene de interesse Sequenciamento do BAC e identificação do promotor Ensaio funcional do possível promotor (próximas aulas)

Estratégia alternativa: genomewalker

Cassete de expressão em sementes Pgkaf hGH 3’ Promotor de sorgo, ativo em sementes de milho Gene humano Terminadora de bactéria Leite, A.; Arruda, P.; El-Dorry, H.; Kemper, E.; da Silva, M.J. Desenvolvimento de um cassete de expressão de proteínas heterólogas especificamente em sementes de plantas transgênicas. Pedido de Patente – INPI: PI9805166-0

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Sistema Gateway (Invitrogen)

Sistema Gateway (Invitrogen) attL1 Gene attL2 KmR Entry Clone attP1 attB1 Gene attL2 attR2 ccdB Cointegrado LR Clonase attL1 x attR1 ccdB attR1 attR2 AmpR Destination Vector

Sistema Gateway (Invitrogen) Gene Amp Expression Clone attB1 attB2 attR2 LR Clonase ccdB attB1 Cointegrado attL2 x attR2 attP1 Gene ccdB Km By- Product attP1 attP2 attL2

Vetores para as mais diversas finalidades Gene 2-Hybrid T7- E. coli ViraPower™ Your Vector Baculovirus CMV-Neo RNAi IVTT CAT gene Gene