VIII CICI – Congresso de Iniciação Científica do IAMSPE Identificação e quantificação de ácido hialurônico da matriz extracelular pela técnica fluorimétrica no tecido colorretal neoplásico e não neoplásico VIII CICI – Congresso de Iniciação Científica do IAMSPE Ac. Caio Dal Moro Alves FMABC Orientador: Prof. Dr. Jaques Waisberg

introdução * Estudo realizado na Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), no Serviço de Gastroenterologia Cirúrgica do Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo (IAMSPE) e no Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina do ABC.

penetração de células neoplásicas na matriz extracelular aumento da expressão das proteases induzindo respostas Ácido Hialuroniano (AH): polissacarídeo encontrado na superfície celular e matriz extracelular de quase todos os tecidos humanos um dos principais componentes que cercam as células tumorais, incluindo as de carcinoma de colon YURCHENCO, P.D., SCHITTNY, J.C. (1990) - Molecular architeture of basement membranes. FASEB J 4: 1577-1590. LIOTTA, L.A. and WEWER, R C. (1986) - Biochemical interactions of tumor cells with the basement membranes. Annual Reviews of Biochemistry 55: 1037 - 1057

Concentrações elevadas de AH encontradas em: Tecidos com alta proliferação Tumores malignos como gástrico e colorretal Em tecidos Neoplásicos, estimulam adesão e neovascularização HERSZÉNYI, L.; PLEBANI, M.; CARRARO, P.; DE PAOLl, M.; ROVERONI, G.; CARDIN, R; FOSCHIA, F.; TULASSAY, Z.; NACCARATO, R and FARINATI, F. (2000) - Proteases in gastrointestinal neoplasic diseases. Cliniea Chimiea Aeta, 291: 197­187 DIETRICH, C.P. (1984) - A model for cell-cell recognition and control of cell growth mediated by sulfated glycosaminoglycans. Braz. J. Med. Bio!. Res. 17: 5 - 15 SAMPAIO, L.O. and DIETRICH, C.P. (1981) - Changes of sulfated mucopolysaccharides and mucopolysaccharidases during fetal development, The Journal of Biological Chemistry 256: 9205-9210

objetivo

Verificar, por espectrometria de massa, a presença e a quantificação de glicosaminoglicanos no tecido colorretal neoplásico e não neoplásico.

Material e Métodos Esse estudo foi realizado de acordo com os padrões éticos aceitos pela Declaração de Helsinki da Associação Médica Mundial, adotado em 1964 e emendado em 1996. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do IAMSPE (Parecer nº 090/04).

Casuística Critérios de Inclusão: doentes adultos, de ambos os sexos, com carcinoma do intestino grosso confirmado pelo estudo histopatológico da lesão Critérios de Exclusão: presença de outra neoplasia maligna concomitante ou prévia em qualquer outra localização Amostras de tecidos obtidas de 64 pacientes com carcinoma colorretal sem doença metastática e que foram operados de 2005 a 2006 no Departamento de Cirurgia do Hospital do Servidor Público Estadual

Idade Média: 68,5±7,3 anos (44 a 81 anos) Localização do CA: 64 pacientes: 37 mulheres (57,8%) 27 homens (42,2%) Idade Média: 68,5±7,3 anos (44 a 81 anos) Localização do CA: 32 no Reto (50,0%) 32 no Colon (50,0%) 17 Direito (26,6%) 15 Esquerdo (23,4%) Duas amostras de cada paciente! Área macroscópica de tecido neoplásico Área de tecido não neoplásico (10cm acima da neoplasia)

Dosagem do AH Realizada por método fluorimétrico Amostras de concentrações desconhecida de AH (proteólise) Diluídas em tampão Tris-HCI 0,05M (pH 7,75, contendo 0,15M de NaCI e 1% de BSA) ELISA (12h; 40º) Incubação com sonda Biotinilada para AH

Análise Estatística Utilizou-se software SPSS, versão 13.0 (SPSS Inc., lllinois, USA) Média aritmética Desvio Padrão Teste t student com medidas repetidas Nível de significância fixado em 0,05

resultados

Expressão de AH foi menor no tecido neoplásico que na mucosa adjacente não neoplásica. (p=0,87) Figura 1. Espectro de massa referente à degradação do tecido colorretal com hialuronidase (AH, do inglês, HA).

Análise da eletroforese em gel de tris-acetato para verificar o perfil do AH nos tecidos analisados encontrou-se a presença de AH de baixo peso. Figura 2. Gel de tris-acetato com identificação de ácido hialurônico (AH, do inglês, HA) de baixo peso nas amostras de tecido colorretal.

Discussão

O estroma da maioria dos tumores malignos, incluindo o câncer colorretal, tem mostrado conter mais AH do que o tecido correspondente do tecido normal O AH tem diferentes papéis na neovascularização dependendo dos seus fragmentos de baixo peso molecular, os quais podem ser gerados pela atividade da hialuronidase a partir dos carcinomas de colon Zaia, J. and Costello, C.E. (2001)- Tandem mass spectrometry of sulfated heparin-like glycosaminoglycan oligosaccharides. Anal Chem. 75(10):2445-55 SAMPAIO, L.O. and DIETRICH, C.P. (1981) - Changes of sulfated mucopolysaccharides and mucopolysaccharidases during fetal development, The Journal of Biological Chemistry 256: 9205-9210

Os picos encontrados no espectro de massa e no gel de eletroforese referem-se, ao menos em parte, ao AH de baixo peso. Mudanças na superfície celular e composição extracelular influenciam a capacidade de células e tecidos para alterar dinamicamente as respostas para as moléculas de sinalização.

Conclusões

Enorme potencial do método para análise em estudos de interação de glicosaminoglicanos altamente heterogêneos; O ácido hialurônico apresentou menor expressão no tecido tumoral em comparação ao tecido não neoplásico  provavelmente influenciado pelo achado de ácido hialurônico de baixo peso molecular não biotinilado.