Efeito da temperatura e pH na atividade e estabilidade das enzimas Aula de enzimologia Tema Efeito da temperatura e pH na atividade e estabilidade das enzimas Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq.eel.usp.br

Conteúdo: Determinação da temperatura ótima Energia de ativação Estabilidade térmica Parâmetros termodinâmicos 4.1 Enzimas termoestáveis 4.2 Enzimas adaptadas ao frio Influência do pH Termoestabilidade x termofilicidate

INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA AÇÃO ENZIMÁTICA 3  temperatura dois efeitos ocorrem: a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas; a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. temperatura ótima - é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade constante por um período de tempo.

Atividade Enzimática É dada pela medição da velocidade inicial da reação sob uma faixa de condições determinadas

A + B  C + D O aumento na temperatura aumenta o numero de colisões Energia de ativação (Ea) – energia mínima para que uma reação ocorra A + B  C + D

INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA Ea  Lei de Arrhenius Ea pode ser determinada medindo-se a constante de velocidade da reação em ≠ temperaturas. Curva A: gráfico usual. Curva B: o gráfico mostra uma variação definida na inclinação, se em determinada temperatura, uma etapa ≠ se torna limitante da velocidade. Curva C: uma queda brusca na curva indica inativação enzimática.

Determinação dos parâmetros termodinâmicos A + B  C + D velocidade equilíbrio v relaciona-se com Eact Keq relaciona-se com ∆G K – cte Boltzman (1,38×10−23 J. K−1) h – cte Planck (6,626×10−34 J/s)

Determinação dos parâmetros termodinâmicos ∆G = ∆ H - T ∆ S -RT ln K eq = ∆ H - T ∆ S ln Keq = – ∆H 1 + ∆ S R T R ln Kcat.h = – ∆H 1 + ∆ S Kb. T R T R Kcat = Keq.A Keq = kcat/( Kb.T) h Kb – cte Boltzman (1,38×10−23 J. K−1) h – cte Planck (6,626×10−34 J/s)

∆ S R – ∆H R ∆S ∆H

Determinação da Energia de Ativação de uma endoglucanase Dados obtidos em temperaturas entre 25 e 70 oC Ea = 3,32 kJ/mol A temperatura ótima foi a 55oC Ea= 96,7 kJ/mol Plot trifásico(CMC tem 2 conformações até a temp ótima)

Parâmetros determinados a 55 oC A. niger A oryzae cmc 1 H (kJ /mol) 50 0,59 G (kJ /mol) 69 64,57 S (J /mol.K) - 61 - 195 Menor entalpia do transgênico indica que ele é altamente ativo e eficiente

Estabilidade enzimática Capacidade das enzimas de reter sua capacidade catalítica sob diferentes condições de reação ao longo do tempo – função biológica das enzimas e está intimamente associada à sua estrutura tridimensional Desnaturado nativo

Termoinativação Determinação da energia de desativação Ta (oC) t1/2 (min) 47 138,6 53 9,77 56 2,3 Determinação da energia de desativação Ead = 378 kJ/mol

Texto para leitura: M. R. Javed, M. H. Rashid, H. Nadeem, M. Riaz & R. Perveen - Catalytic and thermodynamic characterization of endoglucanase (CMCase) from Aspergillus oryzae cmc-1 Appl Biochem Biotechnol (2009) 157:483–497

Enzimas adaptadas ao frio Em temperaturas baixas a energia cinética do sistema é insuficiente para superar a barreira de reação Como as enzimas evitam um decréscimo na sua atividade como consequência de uma queda na temperatura de 37 para 0o C? ln Kcat.h = – ∆H 1 + ∆ S Kb. T R T R Kcat resultado do decréscimo no ∆ H (menor numero de interações que necessitam ser quebradas durante a formação do estado de transição).

% atividade enzimática máxima INFLUÊNCIA DO pH % atividade enzimática máxima V pH Ionização de grupos em E e/ ou S. A enzima está pelo menos parcialmente desnaturada em pHs afastados do pH ótimo. Efeito de tampões e força iônica.

INFLUÊNCIA DO pH EH22+  EH+ + H+  E + 2H+ pKa = 6,0 pKa = 9,0 inativa ativa inativa EH22+  EH+ + H+  E + 2H+ pKa = 6,0 pKa = 9,0 Em pH desaparecimento das cargas negativas (grupos COOH de Asp e Glu) Em pH desaparecimento das cargas positivas (acúmulo de cargas negativas em grupos COOH e nas tirosinas e cisteínas)

Efeito do pH na V Determinação gráfica dos valores de pKs

Log Vmax x pH = Vmax e pKes1 e pK es2 Log pKs x pH = km nmoles/min (Vmax) Ks 2 0,01 1 6,5 9,66 10 2,3 0,02 1,02 7 9,8 10,8 2,5 0,032 1,03 7,3 9,76 11,7 2,8 0,063 1,06 7,5 12,7 3 0,099 1,09 7,8 9,39 15,3 3,3 0,196 1,18 8 9,08 18,2 3,5 0,307 1,28 8,3 8,33 25 3,8 0,594 1,53 8,5 7,6 31,6 4 0,909 1,82 8,8 6,13 44,8 4,3 1,66 9 5 55 4,5 2,4 3,16 9,3 3,34 70 5,5 9,5 78,4 7,86 1,37 87,7 6 9,26 91,8 Log Vmax x pH = Vmax e pKes1 e pK es2 Log pKs x pH = km Log vmax/ks = pke1 e pke2

pH (Vmax/ks) Log (Vmax/Ks) 2 0,01 -2 6,5 0,97 -0,01 2,3 0,019 -1,72 7 0,91 -0,04 2,5 0,031 -1,51 7,3 0,83 -0,008 2,8 0,059 -1,23 7,5 0,76 -0,012 3 0,091 -1,04 7,8 0,61 -0,21 3,3 0,166 -0,78 8 0,5 -0,3 3,5 0,24 -0,62 8,3 0,33 -0,48 3,8 0,39 -0,41 8,5 4 8,8 0,14 -0,85 4,3 0,66 -0,18 9 0,09 4,5 -0,12 9,3 0,05 -1,3 5 9,5 0,03 -1,52 5,5 -0,013 9,8 0,015 -1,82 6 0,98 -0,0087 10 0,009

pKe1= 4 pKe2 = 8

kM

pKes1 = 5,1 pKes2 = 8,5

pH ótimo de uma endoglucanase pH ótimo – 4,1 a 5,3 - , com atividade máxima no pH 4,4 pKes1 pKes2 Os valores de pKes1 = 3,5 e pKes2 = 6,4 indicam a presença de Asp e Glu como doadores de prótons e His como aceptor.

Estabilidade ao pH

Considerações finais: A estrutura tridimensional da enzima pode ser afetada por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais. Isto torna a atividade enzimática dependente do pH e da temperatura. Características termodinâmicas das enzimas são importantes para identificar a ocorrência de estados conformacionais distintos. Através da determinação da temperatura ótima e da termoestabilidade da enzima é possivel determinar seus parâmetros termodinamicos. Através de medidas da velocidade da reação em função do pH é possíivel especular sobre os grupos envolvidos na catálise.