Testes utilizados em Imunologia Clínica Profa Alessandra Pardini

SISTEMA IMUNOLÓGICO RESPOSTA ESPECÍFICA RESPOSTA HUMORAL Ly B - anticorpos RESPOSTA CELULAR LyT - CD4+/CD8+

Antígenos Definição São substâncias químicas capazes de induzir resposta imune específica, pois são estranhas ao sistema imune, normalmente induzem a formação de anticorpos ou de resposta celular, ou ambas Antígeno é toda a estrutura capaz de reagir com as células do sistema imune (fagócitos, ly T e B)‏ É qualquer molécula que possa ser reconhecida pelos elementos do sistema imune inato ou adaptativo

Características: Imunogenicidade é a capacidade de induzir resposta imune específica Antigenicidade é a capacidade de interagir com anticorpos (Ac) ou linfócitos T (lyT) sensibilizados Obs: imunógeno: substância que possuí epítopos estranhos ao organismo, são substâncias ativadoras específicas) (depende de quanto a substância é estranha ao organismo)‏

Determinante Antigênico ou Epítopo - É a menor porção da molécula antigênica responsável pela propriedade de estimular a produção dos anticorpos, são responsáveis pela interação com o sítio combinatório de anticorpo ou do receptor de antígeno (TCR) de lyT - Tamanho médio de 7x14x34u, correspondendo a 4-6 resíduos de aminoácidos - Cada antígeno pode conter um ou mais epítopos, sendo iguais ou diferentes

Anticorpos Molécula de Ac Sítio de ligação do Ag símbolo Sítio de ligação do Ag antígeno Determinante antigênico (epítopo)‏ Cadeia leve Cadeia pesada Fab Fc Região de dobradiça

- liga-se a mastócitos e basófilos  liberação de histamina - presente no soro e superfície de mastócitos - marcador de alergia e helmintíases - monômero IgE

IgA - aglutinação - neutralização - presente em secreções – leite, lágrima - dímero ou monômero

IgM - ativação de complemento - aglutinação - neutralização - presente no soro - marcador de fase aguda - pentâmero

IgG - ativação de complemento - aglutinação - opsonização e neutralização - atravessa a placenta - presente no soro e fluido intercelular - marcador de imunidade e de fase crônica

Tempo (dias)‏ Primeira exposição ao Ag Segunda exposição ao Ag Resposta secundária Resposta primária Título de Ac no soro ( unidades)‏ Dinâmica de produção de Antocorpos durante a infecção Durante a infecção realiza-se pesquisa de IgG e IgM para diferenciar a fase em que se encontra a doença

Introdução - Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para a detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias que desempenhem papel de antígenos - drogas, hormônios, ácidos nucléicos - Utilizam reagentes não marcados (ppt, aglutinação, floculação e complemento) ou reagentes marcados (fluorescência, radioimunoensaio, imunoenzimáticos)‏ - Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, aplicação específica - Podem ser manuais ou semi ou totalmente automatizadas

- Anticorpos monoclonais e Antígenos recombinantes = maior desenvolvimento (a) Ac monoclonais: produção, homogêneos, caracterizáveis (b) Ag recombinantes: caracterizáveis, produção em larga escala, especificidade Métodos: - aperfeiçoamento, consolidação do que já existe, tecnologias emergentes, melhora da sensibilidade, confiabilidade no resultado, execução mais simples e adaptáveis a automação - métodos multiparamétricos: desafio de detecção de substâncias diferentes simunltâneamente

- Os testes sorológicos têm se tornado cada vez mais refinados e de execução simples, porém, para se garantir a qualidade dos resultados é necessário controle rigoroso - Técnicas cuidadosamente padronizadas (estudo de população, limiar de reatividade) = temperatura, pH, tempo de incubação, títulos, conjugados - As metas para o laboratório clínico devem melhorar a disponibilidade, exatidão e precisão dos testes clínicos, garantir a interpretação correta dos resultados

TÉCNICAS COM REAGENTES NÃO MARCADOS

INTRODUÇÃO

Técnicas rápidasTécnicas rápidas Sistema homogêneoSistema homogêneo Sensibilidade reduzidaSensibilidade reduzida Boa especificidadeBoa especificidade Direta – detecção de AgDireta – detecção de Ag Indireta – detecção de AcIndireta – detecção de Ac Baixo custoBaixo custo Dificultam automaçãoDificultam automação Problemas com reprodutibilidadeProblemas com reprodutibilidade Não permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vezNão permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vez

- quantificação de complexo Ag-Ac - depende de [ ] relativas de Ag e Ac - depende de [ ] relativas de Ag e Ac - excesso - dissolução do precipitado - zona de equilíbrio - precipitação máxima Concentração de Ag Excesso de Ag Excesso de Ac Equivalência Imunoprecipitação PRECIPITAÇÃO

Imunodifusão - difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi sólido - complexo Ag-Ac - simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexo - dupla: ambos movem-se – encontro – complexo - pode ser linear ou radial

Imunodifusão Radial Simples (Mancini) - utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de Ac específicos - perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + 3 concentrações conhecidas do Ag - quantificação de [ ] em soro ou líquor - sensibilidade de 1 a 3 ug/ml de antígeno - uso: Ig séricas, proteína C-reativa e proteínas do sistema complemento

- - diâmetro do halo de precipitação formado relaciona-se com a concentração do Ag - construção de curva padrão permite determinar a conentração do Ag

Imunodifusão dupla (Ouchterlony)‏ - precipitação Ag-Ac - linhas ou arcos - ausência de linhas indica ausência de Ag ou Ac - depende de [ ] e tamanho da molécula, tamanho dos poros do gel, temperatura, [ ] e pureza do ágar - camada de ágar sobre lâmina de vidro - perfuração – aplicação da amostra - desvantagens: lenta e baixa sensibilidade - Uso: vários sistemas antigênicos  artrite reumatóide, lupus, esclerose sistêmica, caxumba

Nefelometria -muito usada em LAC -Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz -Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com sensibilidade adequada e pequenos volumes de amostra, não necessita separação de fases -Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações inespecíficas, múltiplas diluições de Ag muito concentrados -Sensibilidade - 1  g/ml -Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatóide, proteína c-reativa, fatores de coagulação, imunocomplexos e hormônios

Princípio - partículas em suspensão – desvio de luz incidida - dispersão de luz incidente quantificada por um detector Fonte de luz Suspensão de Ac e Ag diluídos Raios de luz focados Raios de luz desviados e refletidos Detector

- Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, xenônio, hélio-neônio ou laser - concentração -curva padrão Nefelômetro acoplado a computador

Turbidimetria -Ag+Ac em suspensão –  luz transmitida -Detector - espectrofotômetro -Vantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e automatizada -Desvantagens: não pode ser usada em amostras muit turvas -Uso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albumina Fonte de luz branca Espectrofotômetro de fibra óptica Absorção e espectro de luz desviada e refletida

Aglutinação - complexo Ag-Ac - agregados visíveis - semi-quantitativa – 500x mais sensível que precipitação - sensibilização de suporte – látex, hemácias - vantagens: < custo, facilidade e rapidez - desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado e acessibilidade - vários tipos

Aglutinação direta - partículas antigênicas insolúveis íntegras ou fragmentadas - Ag presente na partícula / célula – hemácias, bactérias, protozoários e fungos - realizado em tubo ou lâmina - Uso: identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose, leptospirose - para a identificação de ANTÍGENOS (teste DIRETO)‏

Resultado positivo Ag eritrocitário Ac Anti- eritrócito Reagente de Coombs

Aglutinação indireta ou passiva - Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes - hemácias – hemaglutinação - um dos melhores suportes - outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose - detecta IgG e IgM / tratamento com 2-ME - lâmina ou microplaca em “V” ou “U” - Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide, proteína C reativa, ASLO

Esquema de realização de testes de aglutinação em placa

Aglutinação indireta (passiva)‏

Hemaglutinação passiva Ac do soro Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)‏ aglutinação

Reação de microfloculação - VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)‏ - RPR (Rapid Plasm Reagin)‏ - suporte: cristais de colesterol - Ag: cardiolipina - placas escavadas - Uso: pesquisa de reaginas

Reação negativa Reação positiva Resultado VDRL Microscópio óptico 100x

TÉCNICAS COM REAGENTES MARCADOS

Alta sensibilidadeAlta sensibilidade Boa especificidadeBoa especificidade Direta – detecção de AgDireta – detecção de Ag Indireta – detecção de AcIndireta – detecção de Ac Competição – amostra compete com reagente marcadoCompetição – amostra compete com reagente marcado Custo mais alto – produção dos reagentesCusto mais alto – produção dos reagentes Permitem automação completa ou nãoPermitem automação completa ou não Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado AgPermite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag Reagente marcado  Ag ou AcReagente marcado  Ag ou Ac Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligadoSistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado

Reagente marcado Marcação não modifica interação Ag-AcMarcação não modifica interação Ag-Ac Alto custoAlto custo Permite detecção de classes específicas de Ac para um determinado AgPermite detecção de classes específicas de Ac para um determinado Ag Tipo de marcador determina nome do testeTipo de marcador determina nome do testeMARCADOR Radioisótopo  RADIOIMUNOENSAIORadioisótopo  RADIOIMUNOENSAIO Fluorocromo  IMUNOFLUORESCÊNCIAFluorocromo  IMUNOFLUORESCÊNCIA Enzima  ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOTEnzima  ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT

Radioimunoensaio - Primeira técnica com reagente marcado - desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes tratados com o hormônio - radioisótopos - I 125 ou I 131 – ligação a resíduos de tirosina em proteínas vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramas - vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramas - desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional – radiosótopos - Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios

interferente: fração não ligada Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema com fase sólida - Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície contínua (tubos, discos e placas)‏ Ac + traçador + Ag da amostra carbono PEG

Tipos de Radioimunoensaio

Contador de radiação gama cintiladores

Imunofluorescência Imunofluorescência - Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag Excitação (nm) Emissão (nm)‏ Excitação (nm) Emissão (nm)‏ Fluoresceína FTIC Texas Red Texas Red R-ficoeritrina desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada, dificuldade de automação - vantagens: específica e reprodutível - tipos – direta, indireta e citometria de fluxo

Reagentes necessários Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonaisAc marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais Ag ou amostras fixas em lâmina de vidroAg ou amostras fixas em lâmina de vidro Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas – melhoram a intensidade da emissão de fluorescênciaGlicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas – melhoram a intensidade da emissão de fluorescência Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a visualização da fluorescênciaAzul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a visualização da fluorescência Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínimaLâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima

Microscópio de imunofluorescência com epiluminação Filtro de excitação lâmina Fluorescência emitida Filtro de emissão Fonte de luz branca câmera Fibra óptica

Microscópio de imunofluorescência automatizado

Imunofluorescência direta Conjugado - Ac marcado com fluorocromoConjugado - Ac marcado com fluorocromo Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar componentes intracelulares com fluorocromos contrastantesVantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes Desvantagens: um conjugado para cada AgDesvantagens: um conjugado para cada Ag Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de peleUso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele célula Conjugado fluorescente

Adenocarcinoma de glândula salivar humana ITCF diiodeto de propídio

Linfócitos infectados com HIV ITCF

IFI para Sífilis – Treponema pallidum

Imunofluorescência indireta Conjugado Ac antiimunoglobulina específico – classesConjugado Ac antiimunoglobulina específico – classes Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescênciaDiluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há fluorescência Vantagens: sensível, específica, reprodutível, fácil, padronizada, mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes doençasVantagens: sensível, específica, reprodutível, fácil, padronizada, mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes doenças Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de automaçãoDesvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e dificuldade de automação Uso: detecção de Ac para Treponema pallidum (FTA-ABS), Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, auto-Ac.Uso: detecção de Ac para Treponema pallidum (FTA-ABS), Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum, auto-Ac.

Anticorpo Antígeno Reação primária Reação secundária Conjugado Anticorpo FITC lavagem Microscópio de fluorescência Conjugado fluoresncente Anticorpo primário Citosol

Citometria de fluxo PRINCÍPIO: análise individual e simultânea de componentes celulares através da medição do desvio de luz incidente sobre uma célula e de sinais fluorescentes emitidos pela mesma Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares de células por segundoVantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares de células por segundo Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamentoDesvantagens: alto custo, necessidade de treinamento Vários fluorocromosVários fluorocromos Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemiasUso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias

Suspensão de mistura de células Conjugado fluorescente Feixe de laser Detector Defletor Células não- fluorescentes Células fluorescentes

Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos:Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos: - baixo ângulo de dispersão – tamanho das células - ângulo de dispersão de 90 o – granulação das células Fluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada por fotodetectores e convertida em sinais processados, quantificados e analisados por um computadorFluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada por fotodetectores e convertida em sinais processados, quantificados e analisados por um computador Sinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas por um sistema de canais, originado histogramasSinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas por um sistema de canais, originado histogramas

Técnicas imunoenzimáticas - Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado ENZIMA - elevada especificidade - fácil de ser obtida na forma purificada - conjugação a Ag e Ac – sem interferências - produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com pequenas quantidades de enzima - estável - custo acessível - vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase - determina o tipo de substrato

SUBSTRATO CROMOGÊNICO - ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos solúveis ou insolúveis - Quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou comparação com padrão - depende do tipo da enzima utilizada Substrato Produto colorido solúvel ou insolúvel

PEROXIDASE - substrato H 2 O 2 ligado a um cromógeno - substrato H 2 O 2 ligado a um cromógeno - cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB - cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB - cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1- naftol - cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1- naftol FOSFATASE ALCALINA - cromógeno com produto solúvel - NPP - cromógeno com produto solúvel - NPP - cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT - cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT 450amarelolilásP-NFF5-B-4-C-3-IF Fosfatase alcalina 492 laranja, azul marrom, violeta OPD, TMB DAB, 4CN H2O2H2O2H2O2H2O2Peroxidase nmcorcromógenosubstratoenzima

SUBSTRATO FLUORIGÊNICOS - emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima - quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro FOSFATASE ALCALINA - 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4- metilumbeliferona)‏ - 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4- metilumbeliferona)‏ excitação Emissão Fluorescência

SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE - amplificação de sinal  hormônios e marcadores tumorais - amplificação de sinal  hormônios e marcadores tumorais - emitem brilho após serem consumidos pela enzima - emitem brilho após serem consumidos pela enzima - quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro - quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro FOSFATASE ALCALINA - adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion (adamantildioexietano) - adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion (adamantildioexietano) brilho luminol

Immuno-Dot - Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISA - fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon - substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel – mancha (dot) - pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto- radiografia - Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com sensibilidade e especificidade boas - Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos epidemiológicos

Fracione o pente de acordo com o número de amostras Colocar as amostras e os controles nos pocinhos da fileira A Colocar o pente na fileira A e incubar segundo as instruções Colocar o pente na fileira B e incubar Incubar nas fileiras C, D e E. Reação com substrato na fileira F Ler os resultados e comparar com o padrão

ELISA ELISA - capaz de detectar < [ ] Ag e Ac - reagente ligado a uma enzima - imobilização em fase sólida  placa de ploiestireno - Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, baixo custo e adaptação a diferentes graus de automação - tipos: direta, indireta, de captura e de competição - Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas

Resultado  visual (qualitativo)‏  densidade óptica (DO) (quantificação / espectrofotômetro)  Limiar de reatividade (“cut-off”)‏  Titulação (diluição em série)‏  Absorbância  Unidade padrão (absorbância transformada em unidade)‏

Determinação de Ag  ELISA direto de captura  ELISA direto de competição Determinação de Ac Determinação de Ac  ELISA indireto  ELISA indireto de captura  ELISA indireto de competição

ELISA indireto Vantagens: único conjugado para vários sistemasVantagens: único conjugado para vários sistemas Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placaUso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que sensibilizou a placa

Lavadora de microplacas Leitora de microplacas acoplada a computador

Western Blotting - i dentificação de proteínas reconhecidas por Ac - separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de poliacrilamida - transferência eletroforética - nitrocelulose - incubação com amostras - presença de Ac específicos - complexo formado – conjugado - Visualização  cromógeno - precipitado colorido - teste confirmatório

Emprego: Emprego: pesquisa de Ag ou Ac  diagnóstico qual proteína está sendo reconhecida  diferentes perfis  fase da doença

MUITO OBRIGADA, SUCESSO! Com carinho, Profa Alessandra Pardini