Reações de Aglutinação Agregação AG-AC Observado visualmente Teste rápido Tipos de Aglutinação Direta Indireta ou Passiva Reversa (Inibição da Aglutinação) Exemplos de Aplicação da Técnica Teste de gravidez (gonadotrofina coriônica = HCG): urina Rotavírus: fezes Diagnóstico de trombose Crises de anemia hemolítica (ex. falciforme) Eritroblastose fetal (doença hemolítica do recém nascido) Diagnóstico de hepatite B: soro Diagnóstico de Toxoplasmose: hemaglutinação (soro) Teste de tipagem sanguínea (ABO e Rh): banco de sangue

Aglutinação Direta Aglutinação passiva Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação Detecção AG ou AC específicos Quantificação Aglutinação bacteriana Presença de infecção Diferenciação de espécies + Aglutinação passiva Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) +

Reversa (Inibição da Aglutinação) Aglutinante

DIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISA FERTILIDADE Estradiol Ultrasensível Progesterona HCG Estradiol TIREÓIDE TSH Anti-receptor TSH T3 e T4 livres TBG Calcitonina TSH neonatal ENDOCRINOLOGIA ACTH Aldosterona Renina MARCADORES TUMORAIS PSA total PSA livre DIABETES Insulina Peptídio C TOXICOLOGIA ALÉRGENOS AC DE ALERGIAS FARMACOLOGIA DOENÇAS VIRAIS E BACTERIANAS

Radioimunoensaio (RIA) Vantagens Sensível, rápido e preciso Análise quantitativa de reação Ag-AC Limiar detecção: nanogramas (10-9 g) e picogramas (10-12g) Limitações Alto Custo Vida média dos reagentes (radioisótopos) Risco operacional Radioisótopos mais usados 125I - vida média de 57,5 dias e 131I – vida média de 8 dias Etapas do teste Cuva de calibração: diluições de substâncias com concentrações conhecidas (padrões/calibradores) Ensaio Contagem da radiação:  ou  (contador de cintilação) ou γ (contador de radiação gama)

Radioimunoensaio Hormônio proteínas séricas drogas Moléculas marcadas vitaminas Ac Moléculas marcadas com isótopos

desconhecida de analisado Radioimunoensaio Princípio: Ac que reconhece especificamente o analisado Precipitado com baixas contagens Soro tem muito analisado circulante AC + = Soro com quantidade desconhecida de analisado e Soro com analisado marcado I125 Precipitado com altas contagens Soro tem pouco analisado circulante

Imunofluorescência Direto e indireto: interesse Direto e indireto: Usado para pesquisa de AC em células (imunocitoquímica) e tecidos (imunohistoquímica) Ex da aplicabilidade: biópsia de doenças imunológicas (pele, rins, sífilis, herpes simples, varicela-zoster) Sistema Avidina-Biotina: Técnica de amplificação Avidina+Biotina = complexo Avidina pode ser saturada com fluoresceína (verde), ficoeritina (vermelha), peroxidase (M. óptica), ferritina (M. eletrônica). Várias biotinas podem se ligar ao AC = amplificação da fluorescência

Enzimaimunoensaio Quantitativo = reação AG-AC monitorado através de atividade enzimática Vantagens: Alta sensibilidade Reagentes estáveis e seguros Rapidez Exigências para a enzima ser usada no teste: Alta atividade específica Produto formado estável Fácil quantificação Ser estável, de preço acessível e de fácil obtenção Ex: peroxidase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, -galactosidase, anidrase carbônica, acetilcolinesterase, glucoamilase, lisozima, malato desidrogenase, glicose-6-P-desidrogenase, ribonuclease Métodos: ELISA (Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima) Imunoblotting

ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima Imobilização do AC ou AG em um meio sólido (agarose, poliacrilamida, placas poliestireno,etc) Bloqueio dos sítios reativos da placa com proteína (leite desnatado, soroalbumina bovina, gelatina, caseína, etc). 3. Diluição da amostra 4. Lavagens entre os períodos de incubação 5. Para revelação da reação usar substrato cromogênico da reação enzimática (ex. H2O2, ortotoluidina).

ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima Objetivo: Quantificar um antígeno pelo uso de um AC específico ligado à enzima Quantificar um AC pelo uso de um AG específico ligado à enzima

(bandas e radiografia) ELISA: dot-ELISA (Immuno-dot ou dot-blot ELISA) membrana nitrocelulose + Ag ( ) Adição de Anti-Ig* * = Enzima (peroxidase, fosfatase ou glicose oxidase) + Lavagem Adição do substrato da enzima COR Amostra + Lavagem Bloqueio Leite desnatado ou Tween 20 + Lavagem Ou conjugados marcados com radioisótopos (bandas e radiografia) ELFA: Enzyme Linked Fluorescent Assay Ensaio Fluorescente Ligado à Enzima – Enzima catalisa reação fluorescente e não colorimétrica Simples, rápida e sensível proteínas, ácidos nucléicos, membranas, fungos, vírus, bactérias