MÉTODOS LABORATORIAIS DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS PARASITÁRIAS

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1 MÉTODOS LABORATORIAIS DE DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS PARASITÁRIAS

2 Diagnóstico Clínico Diagnóstico Laboratorial
FLUXOGRAMA DIAGNÓSTICO DOENÇAS INFECTO-PARASITÁRIAS Anamnese Informações epidemiológicas Sintomatologia Diagnóstico Clínico Diagnóstico Laboratorial IMUNOLÓGICO ETIOLÓGICO Demonstração do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro Estudo da resposta imune em provas imunológicas CONFIRMATÓRIO CERTEZA LIMITAÇÕES

3 MÉTODOS PARASITOLÓGICOS

4 MÉTODOS PARASITOLÓGICOS Simples, rápido e de baixo custo
MICROSCOPIA DIRETA Consiste na identificação direta do parasito em lâminas preparadas com o material coletado (sangue, fezes, tecidos) do paciente PROCEDIMENTO Fixação do material em lâmina (metanol) Coloração (corantes específicos) OU análise a fresco Identificação de formas do parasito (móveis, extra e intracelulares (tipos de células infectadas), cistos, ovos) Visualização em Microscópio óptico Identificação estrutural – Diagnóstico diferencial Simples, rápido e de baixo custo LIMITAÇÕES : sensibilidade variável, utilização limitada á fase aguda

5 MICROSCOPIA DIRETA DOENÇA DE CHAGAS
Trypanosoma cruzi em esfregaço de sangue – coloração Giemsa

6 LEISHMANIOSE VISCERAL
MICROSCOPIA DIRETA LEISHMANIOSE VISCERAL Mielograma de paciente portador de Calazar

7 Cistos de Entamoeba hystolytica em fezes consistentes
MICROSCOPIA DIRETA AMEBÍASE Cistos de Entamoeba hystolytica em fezes consistentes a fresco Lugol LIMITAÇÕES: sensibilidade= 50% (quando o portador elimina cistos/dia)

8 Trofozoítos de Entamoeba hystolytica em fezes diarréicas
MICROSCOPIA DIRETA AMEBÍASE Trofozoítos de Entamoeba hystolytica em fezes diarréicas A fresco Azul de Metileno LIMITAÇÕES: Tempo decorrente da coleta até a realização do exame (curto período de vida dos trofozoítos no exterior 15 a 30 minutos); Microscopista experiente (Diagnóstico diferencial);

9 MÉTODOS PARASITOLÓGICOS
CRESCIMENTO DO PARASITO EM CULTURA Permite o isolamento e identificação de parasitos presentes em fragmentos de biópsia, punção aspirativa, sangue, etc… Fins de estudos de confirmação etiológica, caracterização bioquímica e imunoquímica do parasito PROCEDIMENTO Incubação (análise do crescimento) Semeadura direta do sedimento de amostras em meios de cultura (acelulares) e temperatura adequados Tempo variável (de acordo com a curva de crescimento do parasito) Visualização dos parasitos em cultura por microscopia óptica LIMITAÇÕES : sensibilidade variável devido á técnica de coleta, uso prévio de drogas, tempo prolongado de incubação, meio de cultura empregado, dentre outros

10 MÉTODOS PARASITOLÓGICOS
BIOLOGIA MOLECULAR PCR (Polimerase Chain Reaction) Permite amplificar em escala exponencial sequências de DNA, sendo capaz de detectar 1 fentograma (10-15 g) do DNA – equivalente a 1/10 do parasito Finalidade: estudos de confirmação etiológica, caracterização bioquímica e imunoquímica do parasito PROCEDIMENTO

11 PCR – CICLOS DE AMPLIFICAÇÃO

12 DETECÇÃO DO DNA AMPLIFICADO

13 RESUMO DA TÉCNICA DE PCR
LIMITAÇÕES : altamente sensível e específica, mas trata-se de um teste sofisticado, com exigências técnicas e custo elevado, o que ainda limita seu emprego na rotina laboratorial, sendo aplicado até o momento em laboratórios de referência e centros de pesquisa

14 MÉTODOS SORO-IMUNOLÓGICOS
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL MÉTODOS SORO-IMUNOLÓGICOS

15 PRINCÍPIOS DOS MÉTODOS SOROLÓGICOS
“Visualização” de uma reação antígeno-anticorpo

16 PRINCIPAIS TIPOS DE MÉTODOS SOROLÓGICOS
Hemaglutinação indireta Imunofluorescência ELISA - Enzimaimunoensaio Citometria de Fluxo

17 IMPORTÂNCIA DA PESQUISA DE ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL
Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais clínicos confundíveis; Diferenciar a fase da doença; Diagnosticar doença congênita; Selecionar doadores de sangue ( Triagem sorológica); Selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes; Avaliar o prognóstico da doença; Avaliar a eficácia terapêutica; Verificar o agravamento da patologia.

18 Estabelecer a prevalência da doença;
IMPORTÂNCIA DA PESQUISA DE ANTICORPOS EM INQUÉRITOS SOROEPIDEMIOLÓGICOS Estabelecer a prevalência da doença; Verificar a erradicação da doença; Verificar a reintrodução de casos novos em áreas consolidadas.

19 DETERMINAÇÃO DO LIMIAR DE REATIVIDADE – PONTO DE CORTE
100 doentes 80 absorbância 60 indeterminados 40 20 não-doentes Negativo Negativo Fracamente + Fracamente + Altamente + Altamente +

20 DESEMPENHO DE UM TESTE SOROLÓGICO
- Sensibilidade = a porcentagem de resultados verdadeiramente positivos dentro da população de doentes. - Especificidade = a porcentagem de resultados verdadeiramente negativos dentro da população de não-doentes. 100 Falso Positivos 82% sensibilidade 80 Absorbância 60 40 Falso Negativos 18% 20 86% especificidade Não Doente Doente n = 14 n = 28 Dilui ç ão 1:1.024

21 EXEMPLOS DE MÉTODOS SORO-IMUNOLÓGICOS

22 HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA - HAI
Boyden, 1951, verificou que proteínas podiam ser adsorvidas a hemácias tratadas com ácido tânico, e que essas células podiam ser aglutinadas por anticorpos específicos. Hemácias de mamíferos ou de aves Ags de Leishmania Fins: Diagnóstico Triagem e Inquéritos soroepidemiológicos Ac anti-Leishmania (amostra do paciente) Reação positiva: doente Reação negativa: não-doente

23 HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA - HAI
Teste de referência em inquéritos epidemiológicos VANTAGENS: Fácil execução (antígeno + soro diluído); Rapidez na leitura; Baixo custo - Não necessita de equipamentos sofisticados. LIMITAÇÕES: Estado de conservação dos reagentes (armazenagem indevida); Placas com cargas eletrostáticas; Homogeneização inadequada da placa; Incubação de placas em baixas temperaturas; Soros com anticorpos de reações cruzadas (variada especificidade).

24 + + IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFA) Soro do paciente
FUNCIONALIDADE: Diagnóstico laboratorial para pesquisa de anticorpos no soro e em fluidos biológicos Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno Alvo da técnica Soro do paciente (previamente diluído) Antígenos fixados em lâminas de vidro + lavar lavar + Anticorpos conjugados com fluoresceina (FITC)- Fluorocromo verde Leitura (Microscópio de Fuorescência)

25 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFA)
Trypanosoma cruzi Legionella Pneumophila

26 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA - IFI
Teste de referência na sorologia de muitas doenças VANTAGENS: Reprodutível; Padronização e execução simples; Pode-se determinar classes e sub-classes de anticorpos empregando conjugados específicos. LIMITAÇÕES: Sensibilidade e Especificidade variáveis; Subjetividade na leitura; Técnica não-automatizada; Necessidade de microscópio de fluorescência.

27 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Tipo de técnica imunoenzimática baseada na utilização de anticorpos de revelação conjugados com enzimas. Permite a detecção, titulação e quantificação de substâncias de interesse biológico Detecção de anticorpos no soro ou em fluidos biológicos Detecção de antígenos no soro ou em fluidos biológicos

28 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Diferentes sistemas de Revelação da Reação

29 ELISA Teste de referência na sorologia de muitas doenças VANTAGENS:
Execução simples; Permite a utilização de uma ampla gama de antígenos; Reprodutível; Muito utilizada em investigações científicas; Pode-se determinar classes e sub-classes de anticorpos empregando conjugados específicos. LIMITAÇÕES: Especificidade variável; Custo elevado (reagentes); Utiliza apenas uma diluição da amostra-teste; Exigências laboratoriais.

30 PESQUISA DE ANTICORPOS PELA CITOMETRIA DE FLUXO
Procedimento 50 50 m m l dos Soros Testes l dos Soros Testes 50 50 m m l de Suspensão de Substrato l de Suspensão de Substrato inativados inativados dilu dilu í í dos dos Antigênico em Suporte S Antigênico em Suporte S ó ó lido lido 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Parasitos vivos/fixados Parasitos vivos/fixados Dilui Dilui ç ç ão seriada 1: : ão seriada 1: : 30min, 37 30min, 37 C C Lavar 2X com PBS Anticorpo Anticorpo a a - - IgG conjugado com FITC 30min, 37 30min, 37 C C Lavar 2X com PBS Fixação em paraformaldeído Leitura no Citômetro de Fluxo

31 DOENÇAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DOENÇAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS

32 ISOLAMENTO, CULTIVO E CARACTERIZAÇÃO
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ISOLAMENTO, CULTIVO E CARACTERIZAÇÃO

33 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA EM LABORATÓRIO
Isolamento de bactérias em amostras clínicas – Método de Esgotamento do Inóculo (estria simples ou composta) Identificação bacteriológica – Estudo etiológico – Métodos baseados em características morfológicas e Bioquímicas

34 PRINCIPAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
1º. – Cultura em meios apropriados – seletivos Salmonella spp – meio Rambach E. coli – meio de Mackonckey Microbiota comensal – meio SS Microbiota comensal – meio gelose de sangue

35 PRINCIPAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
2º- Identificação (Características morfológicas e tintoriais) Coloração de Gram Streptococcus mutans coletados de culturas em ágar sangue

36 PRINCIPAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
3º- Diagnóstico diferencial Provas para identificação de vias metabólicas utilizadas pelos microrganismos: Teste da coagulase Teste da catalase Fermentação Amilase Citrato-permease Triptofanases

37 PRINCIPAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
3º- Diagnóstico discriminatório – Testes mais específicos BIOLOGIA MOLECULAR – PCR - DETECÇÃO DE ANTÍGENOS BACTERIANOS

38 PRINCIPAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
4º- Diagnóstico CONFIRMATÓRIO – ELISA – Identificação sorológica de uma resposta de anticorpos contra o agente infeccioso – Caracterização de cepas - Reação de Imunofluorescência Indireta

39 PRINCIPAIS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
5º- Susceptibilidade a antimicrobianos Antibiograma

40 DOENÇAS CAUSADAS POR VÍRUS
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DOENÇAS CAUSADAS POR VÍRUS

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43 Presentes em diferentes materiais, como urina, secreções da orofaringe, sangue, sêmen, e fragmentos de órgãos obtidos por biópsia

44 VANTAGENS : Alta sensibilidade e especificidade
LIMITAÇÕES : Cuidados na coleta; Transporte adequado; Análise temque ser realizada no menor tempo possível; Contaminação do material com fungos e bactérias; Manutenção de culturas celulares.

45 LIMITAÇÕES : necessita de equipamento sofisticado e caro, pessoal altamente treinado, sensibilidade relativamente baixa (as amostras têm que ter altas concentrações virais)

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