KIT CMV BRITE TURBO Antigenemia para CMV por Imunofluorescência.

Apresentação em tema: "KIT CMV BRITE TURBO Antigenemia para CMV por Imunofluorescência."— Transcrição da apresentação:

1 KIT CMV BRITE TURBO Antigenemia para CMV por Imunofluorescência

2 Características do Kit
. Resultados em até 2 horas . Requer de 1 a 2 ml de amostra . Kit completo . Procedimento simples . Fácil interpretação do resultado . Recomendado para diagnóstico e monitoramento de infecções por CMV . Registrado na Anvisa e FDA (EUA)

3 Apresentação da Técnica
I. Preparação da suspensão de leucócitos . Diluir a solução de lise 1:10 em água destilada (4oC). . Misturar 1ml de sangue e completar para 15 ml com a solução de lise e incubar por 15 min a 4oC. . Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante. . Repetir a lise se a primeira for insuficiente, por 5 min. . Ressuspender o pellet em 5 ml de PBS. . Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante. . Ressuspender o pellet em 0,5 ml de PBS (em pacientes com neutropenia severa pode-se suspender am até 0,2 ml).

4 II. Contagem e Concentração Celular
. Utilizar hemocitômetro, contador automático celular ou câmara de Neubauer . Ajustar a concentração em 2x106 células por ml com PBS (ou a critério da instituição).

5 III. Preparação de lâminas de Citocentrifugado
. Centrifugar 100 μl da suspensão celular a 600 rpm por 4 minutos em lâminas de vidro na citocentrífuga. . Preparar pelo menos 2 lâminas por amostra de cada paciente (1 p/ o teste e outra p/ reserva técnica). . Secar as lâminas por 20 minutos. . Circundar o citocentrifugado c/ caneta hidrofóbica. Obs: As lâminas podem permanecer overnight antes da fixação

6 IV. Fixação e Permeabilização
. Diluir o fixador (reag. B) 1:5 em PBS em frasco escuro antes de usar. . Diluir a solução de permeabilização (reag. C) 1:5 em PBS em frasco escuro antes de usar. Não reutilize. . Imergir as lâminas no fixador diluído por 5 min a temperatura ambiente em câmara escura. . Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las imersas por 3 min. . Imergir as lâminas na sol. de permeabilização diluída por 1 min a temperatura ambiente em câmara escura. . Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las imersas por 5 min. Não ultrapassar 60 min.

7 V. Armazenamento de lâminas (congelamento)
. Secar com ventilador por 20 minutos. . Embalar em papel laminado e estocar a 4o C ou congelar a -20o C. Obs: Quando for utilizar, rehidratar por 5 min com PBS.

8 VI. Coloração por Imunofluorescência
. Não deixar que as lâminas sequem durante a coloração. . Rehidratar as lâminas e o controle em PBS por 1 a 2 min. . Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e secar cuidadosamente a área do citocentrifugado. . Aplicar 35 μl do anticorpo monoclonal primário e incubar por 20 min a 37o em câmara úmida e escura. . Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las imersas por 3 min.

9 VI. Coloração por Imunofluorescência (cont.)
. Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e secar cuidadosamente a área do citocentrifugado. . Aplicar 35 μl do anticorpo conjugado e incubar por 20 min a 37o em câmara úmida e escura. . Lavar 2 vezes em PBS e retirar o excesso batendo a Lâmina em papel absorvente. . Montar com glicerina tamponada diluída e cobrir com lamínula.

10 VII. Leitura das lâminas
. Realizar a leitura assim que possível. As lâminas podem ser estocadas a 4o C em câmara fechada para minimizar a perda da fluorescência. . Utilizar microscópio de fluorescência usando aumento de 400x. O aumento de 1000x pode ser usado para aumentar a resolução e tirar dúvidas. . Ler toda a lâmina. Células positivas mostram coloração verde-amarelada no núcleo polilobulado da célula.

11 VIII. Controle de Qualidade
relada. Se os controles não apresentarem estes resul- . Lâminas controle negativas e positivas devem ser coradas Em paralelo com as amostras para demonstrar colora- ção apropriada. O controle positivo mostra coloração homogênea verde-amarelada ao redor do núcleo. O controle negativo não apresenta coloração verde-ama- tados a coloração deve ser considerada inválida. Controle Positivo