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KIT CMV BRITE TURBO Antigenemia para CMV por Imunofluorescência.

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1 KIT CMV BRITE TURBO Antigenemia para CMV por Imunofluorescência

2 Características do Kit. Resultados em até 2 horas. Requer de 1 a 2 ml de amostra. Kit completo. Procedimento simples. Fácil interpretação do resultado. Recomendado para diagnóstico e. Registrado na Anvisa e FDA (EUA) monitoramento de infecções por CMV

3 Apresentação da Técnica I. Preparação da suspensão de leucócitos. Diluir a solução de lise 1:10 em água destilada (4 o C).. Misturar 1ml de sangue e completar para 15 ml com a solução de lise e incubar por 15 min a 4 o C.. Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante.. Repetir a lise se a primeira for insuficiente, por 5 min.. Ressuspender o pellet em 5 ml de PBS.. Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante.. Ressuspender o pellet em 0,5 ml de PBS (em pacientes com neutropenia severa pode-se suspender am até 0,2 ml).

4 II. Contagem e Concentração Celular. Utilizar hemocitômetro, contador automático celular ou câmara de Neubauer. Ajustar a concentração em 2x10 6 células por ml com PBS (ou a critério da instituição).

5 III. Preparação de lâminas de Citocentrifugado. Centrifugar 100 μl da suspensão celular a 600 rpm por 4 minutos em lâminas de vidro na citocentrífuga.. Preparar pelo menos 2 lâminas por amostra de cada paciente (1 p/ o teste e outra p/ reserva técnica).. Secar as lâminas por 20 minutos.. Circundar o citocentrifugado c/ caneta hidrofóbica. Obs: As lâminas podem permanecer overnight antes da fixação

6 IV. Fixação e Permeabilização. Diluir o fixador (reag. B) 1:5 em PBS em frasco escuro antes de usar.. Diluir a solução de permeabilização (reag. C) 1:5 em PBS em frasco escuro antes de usar. Não reutilize.. Imergir as lâminas no fixador diluído por 5 min a temperatura ambiente em câmara escura.. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las imersas por 3 min.. Imergir as lâminas na sol. de permeabilização diluída por 1 min a temperatura ambiente em câmara escura.. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las imersas por 5 min. Não ultrapassar 60 min.

7 V. Armazenamento de lâminas (congelamento). Secar com ventilador por 20 minutos.. Embalar em papel laminado e estocar a 4 o C ou congelar a -20 o C. Obs: Quando for utilizar, rehidratar por 5 min com PBS.

8 VI. Coloração por Imunofluorescência. Não deixar que as lâminas sequem durante a coloração.. Rehidratar as lâminas e o controle em PBS por 1 a 2 min.. Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e secar cuidadosamente a área do citocentrifugado.. Aplicar 35 μl do anticorpo monoclonal primário e incubar por 20 min a 37 o em câmara úmida e escura.. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las imersas por 3 min.

9 VI. Coloração por Imunofluorescência (cont.). Lavar 2 vezes em PBS e retirar o excesso batendo a Lâmina em papel absorvente.. Aplicar 35 μl do anticorpo conjugado e incubar por 20 min a 37o em câmara úmida e escura.. Montar com glicerina tamponada diluída e cobrir com lamínula.. Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e secar cuidadosamente a área do citocentrifugado.

10 VII. Leitura das lâminas. Ler toda a lâmina. Células positivas mostram coloração verde-amarelada no núcleo polilobulado da célula.. Utilizar microscópio de fluorescência usando aumento de 400x. O aumento de 1000x pode ser usado para. Realizar a leitura assim que possível. As lâminas podem ser estocadas a 4 o C em câmara fechada para minimizar a perda da fluorescência. aumentar a resolução e tirar dúvidas.

11 VIII. Controle de Qualidade relada. Se os controles não apresentarem estes resul-. Lâminas controle negativas e positivas devem ser coradas Em paralelo com as amostras para demonstrar colora- ção apropriada. O controle positivo mostra coloração homogênea verde-amarelada ao redor do núcleo. O controle negativo não apresenta coloração verde-ama- tados a coloração deve ser considerada inválida. Controle Positivo


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