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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL- LABIOEX Florianópolis,

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Apresentação em tema: "UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL- LABIOEX Florianópolis,"— Transcrição da apresentação:

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL- LABIOEX Florianópolis, maio de 2011 Ms. Karina Bettega Felipe Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT

2 1. Princípio

3 2. Amostra Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo. 3. Reagentes/soluções/suspensão celular Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de antibióticos penicilina u/mL e estreptomicina µg/mL (1%); Solução de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de meio de cultura completo

4 Suspensão celular na concentração de 0,5X10 5 células/mL 4. Procedimento Preparar uma suspensão celular na concentração de 0,5X10 5 células/mL: a) Retirar o meio de cultura da garrafa

5 b) Lavar a garrafa com PBS c) Adicionar a tripsina

6 d) Esperar a tripsina reagir e) Preparo do meio de inativação

7 f) Inativar a tripsina g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon

8 h) Centrifugar as células i) Retirar meio com tripsina

9 j) Ressuspender as células em meio simples

10 k) Contar as células Nº céls/mL= nº céls contadas/4 x diluição da câmara X diluição amostra Nº céls /mL=nº céls contadas/4 x 10 4 X 10

11 l) Preparar suspensão 0,5 X10 5 células por mL -200 µl/ poço X 96 poços = 19,2 mL - Contagem de células: 5 X 10 5 células/mL -Número de células necessárias: 0,5 X10 5 células – 1000µl X µl X= 9,6 X10 5 células 5 X10 5 células – 1000µl 9,6X10 5 células- X X= 1920µl - Quantos µl da suspensão celular terá 9,6 X10 5 células?

12 - Suspensão utilizada para o teste: - Precisaremos de µl 1920µl de soro 192µl de antibiótico 1920µl da suspensão celular 15168µl de meio 5 X10 5 células – 1000µl 0,5 X10 5 células - X X= 100µl 100µl (0,5 X10 5 células) – 1000µl X µl X= 1920

13 Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço Preparo da suspensão celular

14 24h 24, 48 ou 72 h TRATAMENTO Retirar o meio de cultura

15 Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL) Solução mãe (1000µg/mL) 100µg/mL 1800µL meio 200µL 50µg/mL 1000µL meio 25µg/mL 1000µL meio 12,5µg/mL 1000µL meio 6,25µg/mL 1000µL meio 3,125µg/mL 1000µL meio 1000µL

16 A B C D E F G H ,5 6,25 3,125 CTRL

17 24h 24, 48 ou 72 h TRATAMENTO Retirar o meio de cultura

18 O que vocês vão fazer!!! Preparar solução MTT 2h nm Adicionar DMSO Estabilização da cor Lavar os poços 2X com PBS Retirar o meio 5

19 Preparo da solução de MTT (0,5mg/mL) a)Preparo da solução estoque a 5mg/mL -Pesar 5mg de MTT -Solubilizar em 1,0 mL de PBS estéril. b) Preparo da solução de uso (0,5mg/mL) CV=CV 5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL V= 1mL da solução estoque + 9 mL de meio completo 900µl de soro + 90µl de antibiótico µl de meio

20 O que vocês vão fazer!!! Preparar solução MTT 2h nm Adicionar DMSO Estabilização da cor Lavar os poços 2X com PBS Retirar o meio 5

21 Cálculos Descontar o branco ! Fazer a média da absorbância Considerar o controle como 100% de células viáveis e fazer regra de três para determinar a viabilidade celular das amostras


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