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BMP5748 – 2011 Exame Nome:_____________________________________________ 1. Desenhe oligonucleotideos complementares para inserir direto (sem PCR) a seguinte.

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1 BMP5748 – 2011 Exame Nome:_____________________________________________ 1. Desenhe oligonucleotideos complementares para inserir direto (sem PCR) a seguinte sequência no sítio BamH1 do gene mostrado, resultando numa versão híbrida e funcional do gene ( mantendo a fase de leitura, os codons estão indicados em tripletts). Sequência a inserir (HA tag): 5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT3 Sequência gene alvo (clonado em vetor pGEM T easy): 5 ATG CCA TCA ACT GGG TGT TCT AAC TCA TCC CCG ACT TTT AAA CAT GAG CTG CAG ATC ATG GCG GAT CCG CTA CAG TTC GGT GGG CTA TCA AGG CTC CAG CTT GTT ACG ATT CTT ATA CCA TAG 3 2. O organismo Trypomodium cansativum é um parasita intracelular que invade, se multiplica e assim destroi linfócitos da onça parda, levando assim à sindrome de imunodeficiencia e morte precoce deste animal. No parasita foi descoberta uma familia multigenica (Tc_var) de 100 membros que codifica antígenos importantes na invasão. Devido ao seu tamanho, estes antigenos podem ser classificados em 10 classes (A-J) que diferem em 3-4 kDa de uma classe para a outra. Você estuda estes antigenos/genes (modelo do gene am A). Tendo em mãos todos os genes clonados e um anticorpo contra a porção conservada das proteinas (A), você faz primeiramente uma análise da regulação de transcrição (B) e expressão dos antígenos (C) de parasitas recolhidos e recebe o seguinte resultado: Ectodomínio polimórfico TM dominio conservado epitopo do anticorpo antiTC_var N-termino conservado ABCDEFGHIJABCDEFGHIJ Microarray with polymorphic domains amplified with oligos * each class with 10 members Western blot using antiTC_var A B C 120 kDa 110 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa * Size range of TC-var proteins classes

2 Continuação 2: Interprete os resultados relativos a transcrição e tradução de proteínas Tc_var. 3. Você faz um nuclear run-on assay com o mesmo material de parasitas de pergunta 2 e recebe o resultado abaixo. A) Descreva brevemente como o ensaio funciona tecnicamente. B) O que você conclui para a transcrição dos genes TC_var? Microarray polymorphic domains each class with 10 members 4. Tentando descobrir mecanismos que influem neste modo de expressão de genes TC_var, consegue knockouts em 2 genes potencialmente envolvidos na regulação da transcrição de TC_var. A partir de material de parasitas knockouts você mede transcrição por microrarray e expressão de proteinas como feito em 2 B e C. ABCDEFGHIJABCDEFGHIJ Microarray polymorphic domains each class with 10 members Western blot using antiTC_var A B 120 kDa 110 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa Parasita knockout no gene MLE (multiple ligands expressed) classes

3 ABCDEFGHIJABCDEFGHIJ ABCDEFGHIJABCDEFGHIJ Microarray polymorphic domains each class with 10 members Western blot using antiTC_var CD 120 kDa 110 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa Parasita knockout no gene CAP1 (chromatin associated protein 1) A partir dos resultados 4 A-D, sugira uma função para MLE e CAP1. classes 1. O desenho dos oligos deve considerar a sequência e fase de leitura no 5 (para ficar na fase com o gene onde será inserido o HA tag) e 3 do sitio BamH1 (para continuar na fase de leitura no gene onde será inserido o HA tag). Sendo assim, a sequência com HA tag inserida deve ser (três letras juntas um codon) 5-GCG GAT CCG TAC CCA GAT GTT CCA GAT TAC GCT GCG GAT CCG C-3. Note que os nts sublinhados servem para manter a fase de leitura. Como temos pouca BamH1 no lab, vou desenhar 2 oligos que hibridados já formam um sitio BamH1 clivado (assim os oligos tb são mais curtos! Tem a desvantagem que vou ter que fosforilar os oligos no 5 antes de usar, tudo bem): 5- GAT CCG TAC CCA GAT GTT CCA GAT TAC GCT GCG (fita sense) 5- GATCCGC AGC GTA ATC TGG AAC ATC TGG GTA CG -3 (fita antisense) 2. Nos rersultados do microarray que revela a presença de transcritos (e se for ainda possivel uma densitometria dos spots que não enxergo aqui poderia ver até a quantidade de cada transcrito) podemos ver que vários genes Tc_var apresentam transcritos, especificamente das classes B, D, F, H, I. Em outras palavras, se todos os genes Tc_var forem representados no array, o organismo possui naquele momento 7 transcritos Tc_var diferentes (B3, B9, D6, F3, H7, H9, I2). No Western blot onde uso um anticorpo contra a parte conservada das proteinas (assumo que a performance deste ac é igual para todas as proteinas TC_VAR), vejo apenas uma banda na altura das proteinas da classe D, ou seja, é muito provavel que apenas a proteina TC_VAR D6 esteja presente no parasita – já que dessa classe apenas um gene apresentou transcrito. Temos aqui algum controle póstranscripcional na expressão de genes Tc_var que suprime a tradução dos transcritos. Respostas corretas

4 3. No nuclear run-on é testada a presença de transcrição ativa e não de transcritos prontos como no Northern blot ou num microarray onde utiliza –se cDNA marcado como sonda. O procedimento inclui o isolamento de núcleos intactos, que são incubados com NTPs radioativamente marcados no alfa- 32 P. Assim, o RNA que estava sendo transcrito neste momento no nucleo é radioativamente marcado e após purificação com métodos adequados (extração com fenol/trizol e precipitação) pode ser utilizado como sonda num microarray radioativo, neste caso usaria um dot-array com representantes Tc_var espotados como mostrado já em tarefa 2. Assim cada transcrito nascente hibridaria com um spot do referente Tc_var do array (previamente desnaturado para estar em single strand). Já o resultado deste ensaio me mostra que os mesmos genes dos quais vi transcritos num microarray comum também vejo transcritos nascentes. Ou seja, transcritos que estão presentes de fato são produzidos naquele momento (e não anteriormente), e há de fato 7 loci dos quais nascem estes transcritos. 4. No knockout do gene MLE vejo uma derepressão de tradução, ou seja: todos os transcritos presentes parecem ser traduzidos (tem sinal no Western!) com a ressalva que o Western não me resolve se os dois genes Tc_var classe H de fato são traduzidos. Me parece que o MLE pode ser uma RNAs/DEAD box Helicase, semelhante a DHH1 de T cruzi ou DOZI de P. berghei, ela recrutaria os mRNAs de Tc_var. Mas por que ela não reprime a tradução de um único RNA no wildtype (que é traduzido), eu não sei. Já o CAP1 parece exercer uma função de repressor de transcrição, mas não de todos os genes Tc_var, já que não reprime alguns genes transcritos no wildtype. No knockout, todos os genes são transcritos e com a presença de MLE, que provavelmente recrutou os transcritos evitando tradução. Entretanto, como antes, apenas um único transcrito é traduzido (uma banda no Western). A transcrição de Tc_var me parece muito complexo e faltam vários componentes a serem identificados para montarmos um modelo consistente. Por exemplo, quem licencia loci para serem transcritos na presença de CAP1? Ou ainda, quem licencia transcritos feitos para serem traduzidos na presença de MLE?

5 Classificação final curso 2011 As notas finais foram atribuidas da seguinte maneira: Todo mundo que participou todos os dias e estava presente na avaliação automaticamente alcança conceito C. Pontuação no exame entre 0 e 1,33 pontos resulta em conceito C, entre 1,34 e 2,66 fica com conceito B, e acima 2,66 é conceito A. Em nenhum caso foram descontados pontos por faltas. Aluno/aConceitoPontos no exame (max 4) Eduardo Alves dos Santos A3 Wesley Luzetti Fotoran A3,9 Natalia Lopez OrozcoC0,4 Marcell CrispimC1,1 Nahiara Esteves ZorgiA3 Jaqueline RodriguesA3,25 Andrea CostaB1,5 Bianca Cechetto Carlos A3,25 Lucas Borges PereiraA3,5 Heloisa Berti GabrielA3,25


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