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Simpósio de Sanidade Avícola (AVISULAT/UFSM) IV Congresso Sul Brasileiro de Avicultura, Suinocultura e Laticínios Thales Quedi Furian 5 de Novembro - 2014.

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1 Simpósio de Sanidade Avícola (AVISULAT/UFSM) IV Congresso Sul Brasileiro de Avicultura, Suinocultura e Laticínios Thales Quedi Furian 5 de Novembro Atualidades em Cólera Aviária

2 Uma das patologias aviárias mais antigas; Diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória; Casos frequentes entre pequenas criações independentes Cólera Aviária

3 Grande concentração de unidades de produção Alta densidade populacional aviários + Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial.... (Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009) Cólera Aviária

4 Grande concentração de unidades de produção Alta densidade populacional aviários (Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009) Baixos níveis de biosseguridade Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial.... Cólera Aviária

5 Doenças respiratórias Grande concentração de unidades de produção Alta densidade populacional aviários Baixos níveis de biosseguridade (Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009) Cólera Aviária Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial....

6 Doenças respiratórias Diferentes hospedeiros e cronicamente infectados Grande concentração de unidades de produção Alta densidade populacional aviários (Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009) Baixos níveis de biosseguridade Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial.... Cólera Aviária

7 Denominação do gênero em homenagem a Louis Pasteur Família Pasteurellaceae 10 gêneros (Pasteurella, Actinobacillus, Haemophilus, Avibacterium) ; (MUHAIRWWA et al., 2001; SNIPES et al., 2002; LEOTA et al., 2006, NASCIMENTO et al., 2009) (HARPER et al., 2006) - constantes reclassificações taxonômicas; “A bactéria Pasteurella multocida é um patógeno enigmático” (WILKIE et al., 2012) número de síndromes relacionadas e de hospedeiros acometidos; agente primário (rinite atrófica, septicemia hemorrágica, cólera aviária)

8 Bacilo Gram negativo; Imóvel, não formador de esporos; Coloração bipolar típica; Anaeróbio facultativo; Figura 1. Micrografia eletrônica – Pasteurella spp Figura 2. Coloração esfregaço sanguineo – P. multocida (CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006; GLISSON, 2008 ) Pasteurella multocida

9 anorexia, cianose, estertores, descargas nasais, diarréia, morte súbita; petéquias, hemorragias, ausência lesões; Cólera Aviária lesões edematosas/inflamatórias associadas com o local de infecção; lesões no sistema reprodutivo; Forma agudaForma crônica Fotos: CORNELL UNIVERSITY, CDPA/UFRGS)

10 Aves silvestres Descrita em mais de 100 espécies Epidemiologia Aves entre semanas mais susceptíveis Lotes clinicamente recuperados Reservatório do agente Aves aquáticas Mamíferos (PETERSEN et al., 2001) (SAMUEL et al., 2007) (MUHAURWA et al., 2001) (WILKIE et al., 2012)

11 Como realizar o diagnóstico laboratorial atualmente?

12 Isolamento convencional (A laboratory manual for the isolation, identification and characterization of avian pathogens - GLISSON et al., 2008) BHI Ágar Sangue 5% sangue ovino desf. Ágar MacConkey 37 o C 24 horas 37 o C 24 horas Testes bioquímicos Teste Catalase Teste Oxidase Colônias compatíveis 37 o C 24 horas BHI anaerobiose aerobiose Coloração Gram/ Azul de metileno Fígado Pulmão Sangue cardíaco Medula óssea

13 Meios de isolamento: ágar sangue, TSA, DSA - 5% soro sanguíneo; Colônias geralmente acinzentadas e lisas; Inoculação em camundongos; - morte em 24 a 48 horas; (Fonte: CDPA/UFRGS, 2008) Figura 3. Colônias de Pasteurella multocida isoladas de diferentes hospedeiros Aves - UFRGSBovinos - UFRGS Suínos - UFRGSATCC (CHRISTENSEN et al., 2007) Diagnóstico

14 Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos - Isolamento regiões contaminadas; - Período para obtenção de subcultivos puros; - Questão bem estar animal; Métodos moleculares de diagnóstico Diagnóstico Detecção do gene pls Detecção do gene kmt (KASTEN et al., 1997) (LEE et al., 2000) (LIU et al., 2004) Detecção dos genes pm0762/pm231 Ensaio 5’ Taq nuclease (CORNEY et al., 2007) (TOWNSEND et al., 1998) Variação método extração DNA

15 Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos - Isolamento regiões contaminadas; - Período para obtenção de subcultivos puros; - Questão bem estar animal; Métodos moleculares de diagnóstico Diagnóstico Detecção do gene pls Detecção do gene kmt (KASTEN et al., 1997) (LEE et al., 2000) (LIU et al., 2004) Detecção dos genes pm0762/pm231 Ensaio 5’ Taq nuclease (CORNEY et al., 2007) (TOWNSEND et al., 1998) Variação método extração DNA

16 Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos - Isolamento regiões contaminadas; - Período para obtenção de subcultivos puros; - Questão bem estar animal; Métodos moleculares de diagnóstico Diagnóstico Detecção do gene pls Detecção do gene kmt (KASTEN et al., 1997) (LEE et al., 2000) (LIU et al., 2004) Detecção dos genes pm0762/pm231 Ensaio 5’ Taq nuclease (CORNEY et al., 2007) (TOWNSEND et al., 1998) Variação método extração DNA Preservação Amostras liofilizadas

17 Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos - Isolamento regiões contaminadas; - Período para obtenção de subcultivos puros; - Questão bem estar animal; Métodos moleculares de diagnóstico Diagnóstico Detecção do gene pls Detecção do gene kmt (KASTEN et al., 1997) (LEE et al., 2000) (LIU et al., 2004) Detecção dos genes pm0762/pm231 Ensaio 5’ Taq nuclease (CORNEY et al., 2007) (TOWNSEND et al., 1998) Variação método extração DNA Preservação Congeladas a -80 o C sangue total ovino

18 Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos - Isolamento regiões contaminadas; - Período para obtenção de subcultivos puros; - Questão bem estar animal; Métodos moleculares de diagnóstico Diagnóstico Detecção do gene pls Detecção do gene kmt (KASTEN et al., 1997) (LEE et al., 2000) (LIU et al., 2004) Detecção dos genes pm0762/pm231 Ensaio 5’ Taq nuclease (CORNEY et al., 2007) (TOWNSEND et al., 1998) Variação método extração DNA Preservação Congeladas a -80 o C soro bovino + 7,5% de glicose (LAPAGE & REDWAY, 1974)

19 Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos - Isolamento regiões contaminadas; - Período para obtenção de subcultivos puros; - Questão bem estar animal; Métodos moleculares de diagnóstico Diagnóstico Detecção do gene pls Detecção do gene kmt (KASTEN et al., 1997) (LEE et al., 2000) (LIU et al., 2004) Detecção dos genes pm0762/pm231 Ensaio 5’ Taq nuclease (CORNEY et al., 2007) (TOWNSEND et al., 1998) Variação método extração DNA Preservação Congeladas a -80 o C BHI+ glicerol

20 Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos - Isolamento regiões contaminadas; - Período para obtenção de subcultivos puros; - Questão bem estar animal; Métodos moleculares de diagnóstico Diagnóstico Detecção do gene pls Detecção do gene kmt (KASTEN et al., 1997) (LEE et al., 2000) (LIU et al., 2004) Detecção dos genes pm0762/pm231 Ensaio 5’ Taq nuclease (CORNEY et al., 2007) (TOWNSEND et al., 1998) Variação método extração DNA Preservação Congeladas a -20 o C soro bovino + 7,5% de glicosesangue total ovinoBHI+ glicerol

21 Patogenia Habitante normal das vias aéreas Manejo inadequado Nutrição deficiente Infestação parasitária Infecções concomitantes (MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012) Trato respiratório superior Principal sítio Infecção do pulmão e sacos aéreos Disseminação para diferentes tecidos Corrente sanguínea Morte Choque septicêmico

22 Patogenia e a virulência das cepas ? ? Invasão da mucosas Vacinas vivas e inativadas Microrganismos oportunistas em vertebrados ? ? ? (CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006; DZIVA et al., 2008; HARPER et al., 2010) Após mais de 125 anos dos trabalhos desenvolvidos por Pasteur...

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24 3511 document results Acesso em 10/10

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26 1167 document results Acesso em 10/10

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28 406 document results Acesso em 10/10

29 “A manipulação genética de P. multocida deve auxiliar na elucidação dos mecanismos patogênicos e da associação com diferentes hospedeiros.” Ian Wilkie – 2012 Department of Microbiology Australian Research Council Centre of Excellence in Structural and Functional Microbial Genomics, Monash University, Australia

30 menor uso de ferramentas de manipulação/análise genética nos últimos 25 anos; primeiro sequenciamento completo do genoma em 2001; CepaCompleto Hospedeiro/ tecido Genoma (Mbp) G+C Pm70simave simbovino/pulmão Anand1Gnãocaprino Anand1Pnãoave/fígado P3480nãosuíno/pulmão X73nãoave VP161nãoave P903nãosuíno M1404nãoBovino Boyce et al., 2012 Tabela 1. Característica do genoma das cepas de Pasteurella multocida sequenciadas Isolados de CA (May et al., 2001)

31 Todas as cepas são fortemente relacionadas; Análise filogenética Não há correlação entre o parentesco filogenético e o local de isolamento, o sorogrupo ou o hospedeiro de origem das amostras;

32 Como e por que classificar os isolados de P. multocida?

33 P. multocida subsp. multocida subsp. septica subsp. gallicida Testes fenotípicos para classificação da subespécie e do biovar Biotipificação: fator chave na identificação de P. multocida; (DZIVA et al., 2008 ) (MUTTERS et al., 1985 ) TesteP. multocidaP. septicaP. gallicida Dulcitol--+ Sorbitol+-+ Enzima α-glicosidase e sequenciamento de genes housekeeping; (HUNT et al., 2001; KUHNERT, P & KORCZAK, B.M., 2006 ) Tabela 2. Características bioquímicas para diferenciação de subespécies de Pasteurella multocida

34 Fermentação Xilose Maltose Ornitina Trehalose Sorbitol Dulcitol Lactose (FEGAN et al., 1995; BLACKALL et al., 1997) Testes fenotípicos para classificação da subespécie e do biovar Classificação das amostras em 13 diferentes biovares Tabela 3. Características bioquímicas dos biovares de Pasteurella multocida

35 SubespéciePercentual (%) multocida87,50 septica10,71 gallicida1,79 Total100 (Dados não publicados, 2014) BiovarPercentual (%) 18,93 27,14 335,71 41,79 53,57 71, ,50 103, ,21 NT0,00 Total100 Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária

36 (Dados não publicados, 2014) BiovarPercentual (%) 18,93 27,14 335,71 41,79 53,57 71, ,50 103, ,21 NT0,00 Total100 MUHAIRWA et al., 2001 PEDERSEN et al., 2003 LEOTTA et al., 2006 SubespéciePercentual (%) multocida87,50 septica10,71 gallicida1,79 Total100 Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária

37 (Dados não publicados, 2014) BiovarPercentual (%) 18,93 27,14 335,71 41,79 53,57 71, ,50 103, ,21 NT0,00 Total100 FEGAN et al., 1995 VARGA et al., 2013 SubespéciePercentual (%) multocida87,50 septica10,71 gallicida1,79 Total100 Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária

38 Biovar 2: hgbB - ; pfhA + Biovar 3: hgbB + ; pfhA - (Dados não publicados, 2014) BiovarPercentual (%) 18,93 27,14 335,71 41,79 53,57 71, ,50 103, ,21 NT0,00 Total100 Não houve associação entre os biovares e a presença de 23 genes de virulência pesquisados (p˃ 0,05)

39 Testes fenotípicos para classificação da subespécie e do biovar Grande número de isolados não tipificáveis; Variações de reprodutibilidade dos testes; Menor poder discriminatório Limitações (MATSUMOTO & STRAIN; 1993; VARGA et al., 2007; DZIVA et al., 2008 ; GARCIA et al., 2011) Combinada com técnicas moleculares de tipificação

40 Tipificação molecular Tipificação: isolados compartilham propriedades que os diferenciam; Testes moleculares X testes de biotipificação

41 Tipificação molecular ( MUHAIRWA et al., 2001; CHRISTENSEN & BISGAARD, 2006) Testes moleculares X testes de biotipificação Análise de enzima de restrição - REA Ribotipagem Análise do Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso - RAPD Sequência Palindrômica Repetitiva - REP Análise do Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição - RFLP Tipificação por sequenciamento de múltiplos loci - MLST Diferenciação de cepas de P. multocida

42 Tipificação molecular Técnica de PCR-RFLP em P. multocida; - discriminação do gene ompH; - estrutura do lipopolissacarídeo; (BOROWSKI et al., 2001; JABBARI et al., 2005; SELLYEI et al., 2013) (TSAI et al., 2011) Amplificação dos genes ompH (Sellyei et al., 2013) ; oma87 (Furian et al., 2013) ; Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária

43 Figura 1. Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo - produto de amplificação gene ompH (aprox pb). A seta preenchida indica fragmento de 500pb. Restriction mapper version 3 GenBank U50907 – ompH gene strain X-73 DraI HindIII PvuII 5’-TTT AAA-3’ 3’-AAA TTT-5’ 5’-A AGCT T-3’ 3’-T TCGA A -5’ 5’-GTPy PuAC-3’ 3’-CApu PyTG-5’ IVI VV VVIIII PM Figura 2. Perfis gerados (I-VII) das cepas de Pasteurella multocida de origem aviária a partir da clivagem do produto de amplificação do gene ompH com as enzimas DraI e HindIII

44 PCR-RFLP Grupo genético Frequência relativa (%) I12,28 II42,11 III3,51 IV3,51 V17,54 VI8,77 VII12,28 Perfis gerados (I-VII) das cepas de Pasteurella multocida de origem aviária a partir da clivagem do produto de amplificação do gene ompH com as enzimas DraI e HindIII Associação do perfil VII com o biovar 13; Alta homologia de alguns perfis com determinados sorotipos; Perfil II Sorotipo 3 Perfil VII Sorotipo 11 Sorotipo 3,4 Sorotipo 2 Perfil III Sorotipo 4 Sorotipo 9 Sorotipo 15 Sorotipo 4 Sorotipo 5,16 Perfil V Sorotipo 10 Sorotipo 12 Sorotipo 14 Sorotipo 6 Sorotipo 7 Sorotipo 8 Sorotipo 13 Perfil VI Figura 3. Relação filogenética da sequência nucleotídica de 638pb do gene ompH entre os perfis gerados através de PCR-RFLP e os diferentes sorotipos de Pasteurella multocida

45 Kruskall-Wallis test (p<0,01) Distribuição do índice de patogenicidade versus perfil genético de isolados de origem aviária de Pasteurella multocida 6,05 8,97 5,81 4,03 8,77 5,62 Grupo genético IP médio I6,05 a II8,97 b III/IV8,77 b V5,81 a VI4,03 a VII5,62 a

46 Métodos de classificação de P. multocida são empregados em estudos epidemiológicos e na diferenciação de cepas isoladas em surtos (DZIVA et al., 2008). A variabilidade antigênica dificulta o estabelecimento de uma vacina eficiente (DAVIES et al., 2003). Importante determinar os sorotipos de P. multocida: bacterinas protegem pobremente contra desafios das cepas heterólogas.

47 Cápsula e LPS: base para a classificação de P. multocida Classificadas em cinco sorogrupos (A, B, D, E, F) Classificadas em 16 sorovares Casos de CA predominantes: sorogrupo A e sorovares 1-3 ou 3-4; antígenos capsulares; antígenos somáticos; (BISGAARD, 2008; HARPER et al., 2012) Cápsula

48 Heparina Glicosaminoglicanos idênticos aos componentes da matriz celular da célula eucariótica Pode não ocorrer resposta imune do hospedeiro (DAVIES et al., 2004; BOYCE et al., 2010) N-acetil-glicosaminaÁcido glicurônico Ácido hialurônico Condroitina

49 Cápsula Resistência à dessecação; Maior adesão (?); Atividade antifagocitária; Interação com o sistema complemento; Importante papel na interação com o organismo infectado cepas com cápsula X mutantes acapsulares (JACQUES et al., 1993; PRUIMBOOM et al., 1996; CHUNG et al., 2001,;BOYCE et al., 2010; HARPER et al., 2012)

50 Métodos de tipificação capsular e relação com a patogenicidade Classificação fundamental: - relação entre tipo capsular, patogenia e predisposição do hospedeiro a um sorogrupo; rinite atrófica septicemia hemorrágica cólera aviária tipo Dtipo B ou Etipo A (JAGLIC et al., 2005; WOO;KIM, 2006; HAPER et al., 2012) Prevalência pode variar conforme a distribuição geográfica e ao longo do tempo;

51 Métodos de tipificação capsular e relação com a patogenicidade (CARTER & RUNDELL, 1973; CARTER & SUBRONTO, 1973; GLISSON et al., 2008; BORRATHYBAY et al., 2003) Tipificação: teste de hemaglutinação indireta - isolados podem não aglutinar com antissoros homólogos; - depende da presença do antígeno capsular; Métodos fenotípicos não-sorológicos - Teste da hialuronidase: amostras do tipo A despolimerização do ácido hialurônico - Teste da acriflavina: amostras do tipo D floculação em caldo - microscopia com luz oblíqua colônias iridescentes - microscopia eletrônica espessura da cápsula (CARTER, 1955) patogenicidade

52 CepaCompleto Hospedeiro/ tecido Genoma (Mbp) G+C Pm70simave simbovino/pulmão Anand1Gnãocaprino Anand1Pnãoave/fígado P3480nãosuíno/pulmão X73nãoave VP161nãoave P903nãosuíno M1404nãoBovino Boyce et al., 2012 Tabela 1. Característica do genoma das cepas de Pasteurella multocida sequenciadas locus de biossíntese da cápsula B:2 (Boyce et al., 2000) locus de biossíntese da cápsula A:1 (Chung et al., 1998)

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54 Cápsula (adapatado de: BOYCE et al., 2000) Região 1: proteínas para transporte dos polissacarídeos da cápsula; Região 3: enzimas para fosforilação; Região 2: enzima para biossíntese dos monômeros de açúcar; cexAcexBcexCcexDlipAbcbI bcbHbcbF lipB bcbGbcbEbcbDbcbCbcbBbcbA hexAhexBhexChexDhyaAhyaBhyaChyaDhyaE phyAphyB Pasteurella multocida A:1 Pasteurella multocida B:2 (CHUNG et al., 1998, BOYCE et al., 2010) Região 01Região 02Região 03

55 Análise Sorogrupo A (%)D (%)NT (%)Total (%) Testes fenotípicos41 (75,93) a 2 (3,7) a 11 (20,37) a 54 (100) Multiplex-PCR49 (90,74) b 3 (5,56) a 2 (3,7) b 54 (100) X2 (1) = 4,267 p= 0,034 (p<0,05) Tabela 4. Tipificação capsular de 54 isolados de Pasteurella multocida de origem aviária com testes fenotípicos não sorológicos e multiplex-PCR Leotta et al. (2006), Shivachandra et al. (2006), Jabbari et al. (2006)

56 Fatores de virulência Cápsula e LPS Fímbrias e adesinas Proteínas externas de membrana Toxina dermonecrótica (ptfA, pfhA, hsf-1, tadA) (ompH, oma87, ompA, plpB) (toxA) (nanH, nanB) (sodA, sodC) (hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur); Sialidases; Superóxido dismutase; Relacionados ao metabolismo do ferro;

57 Cápsula e LPS Fímbrias e adesinas Proteínas externas de membrana Toxina dermonecrótica (ptfA, pfhA, hsf-1, tadA) (ompH, oma87, ompA, plpB) (toxA) (nanH, nanB) (sodA, sodC) (hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur); Sialidases; Superóxido dismutase; Relacionados ao metabolismo do ferro; FHA PtfA Fatores de virulência (adaptado de HATFALUDI et al., 2010)

58 Cápsula e LPS Fímbrias e adesinas Proteínas externas de membrana Toxina dermonecrótica (ptfA, pfhA, hsf-1, tadA) (ompH, oma87, ompA, plpB) (toxA) (nanH, nanB) (sodA, sodC) (hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur); Sialidases; Superóxido dismutase; Relacionados ao metabolismo do ferro; Fatores de virulência OmpH Oma87 (adaptado de HATFALUDI et al., 2010)

59 Cápsula e LPS Fímbrias e adesinas Proteínas externas de membrana Toxina dermonecrótica (ptfA, pfhA, hsf-1, tadA) (ompH, oma87, ompA, plpB) (toxA) Fatores de virulência (nanH, nanB) (sodA, sodC) (hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur); Sialidases; Superóxido dismutase; Relacionados ao metabolismo do ferro;

60 Sialidases; Superóxido dismutase; Relacionados ao metabolismo do ferro; Fatores de virulência Cápsula e LPS Fímbrias e adesinas Proteínas externas de membrana Toxina dermonecrótica (ptfA, pfhA, hsf-1, tadA) (ompH, oma87, ompA, plpB) (toxA) Glicolipídeo Glicoproteína Porção lipídica Porção lipídica Porção glicosídica (adaptado de FÁTIMA et al., 2005) (nanH, nanB) (sodA, sodC) (hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);

61 Sialidases; Superóxido dismutase; Relacionados ao metabolismo do ferro; Fatores de virulência Cápsula e LPS Fímbrias e adesinas Proteínas externas de membrana Toxina dermonecrótica (ptfA, pfhA, hsf-1, tadA) (ompH, oma87, ompA, plpB) (toxA) Cu Zn Ligação dissulfeto (nanH, nanB) (sodA, sodC) (hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);

62 Sialidases; Superóxido dismutase; Relacionados ao metabolismo do ferro; Fatores de virulência Cápsula e LPS Fímbrias e adesinas Proteínas externas de membrana Toxina dermonecrótica (ptfA, pfhA, hsf-1, tadA) (ompH, oma87, ompA, plpB) (toxA) (adaptado de KREWULAK; VOGEL, 2008) TransferrinaSideróforosHemoglobina Periplasma Citoplasma Complexo energético TonB (nanH, nanB) (sodA, sodC) (hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);

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65 Processo ou enzimaGene Frequência absoluta e relativa (%) – cepas aviárias Frequência absoluta e relativa (%) – cepas suínas Proteínas de membrana externa ompH96%98% oma87100% ompA61%95% plpB98% psl96%98% Metabolismo do ferro exbD-tonB98% fur96%98% hgbA98%92% hgbB93%58% Sialidases nanH95%85% nanB98%100% Superóxido dismutases sodA96%100% sodC96%100% Hyaluronic synthetase pmHAS88%92% Toxina dermonecrótica toxA0%3% Adesinas ptfA96%98% pfhA63%53% tadD38%85% hsf-150%20% Tabela 5. Distribuição de 22 genes associados à virulência em Pasteurella multocida detectados por m-PCR conforme o hospedeiro de origem Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)

66 A maioria dos genes de virulência apresenta uma distribuição regular; Alguns genes estão associados com a presença de pasteurelose (EWERS et al., 2006; BETHE et al., 2009; TANG et al., 2009) tbpA +, pfhA +, hgbB + toxA + Em aves não existem relatos de acordo com o status sanitário dos animais Alguns genes estão associados a determinados sorogrupos: Sorogrupo A pfhA +, pmHAS +, hsf-1 - Sorogrupo D toxA +, pmHAS -, hsf-1 -

67 Tabela 6. Frequência absoluta e relativa (%) dos genes associados à virulência detectados por PCR conforme os sorogrupos A e D de Pasteurella multocida Gene Sorogrupo A (gene hyaD-hyaC) (n=88) Sorogrupo D (gene dcbF) (n=6) ompH 85 (97%)6 (100%) ompA 65 (74%)6 (100%) plpB 86 (98%)6 (100%) psl 86 (98%)5 (83%) exbD-tonB 86 (98%)6 (100%) fur 85 (97%)6 (100%) hgbA 84 (95%)6 (100%) hgbB 67 (76%)6 (100%) nanH 79 (90%)6 (100%) nanB 87 (99%)6 (100%) sodA 86 (98%)6 (100%) sodC 86 (98%)6 (100%) pmHAS 86 (98%) b 0 (0%) b toxA 0 (0%)1 (17%) a ptfA 85 (97%)6 (100%) pfhA 56 (64%) a 0 (0%) a tadD 53 (60%)0 (0%) a hsf-1 28 (32%) b 6 (100%) a Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014) a em negrito: associação significativa (p<0.05) b em negrito: associação significativa (p<0.001)

68 ompHtoxAptfAnanH exbD- tonB sodApfhAhgbAsodCnanBhgbBoma87hsf-1furpmHASpsIompAplpBtadA ompH100 toxA1100 ptfA nanH93 * exbD-tonB 100 * * 100 sodA pfhA hgbA * * 100 sodC * nanB100 * * * 100 hgbB * oma87100 hsf-136 * * * fur99 * * * * 100 pmHAS * * psl99 * * * * 99 * ompA77 * * * * 7539 ** 77 * plpB100 * * 100 ** * * * 100 tadD * * ** 5728 * 59 * 62 * 5974 * Tabela 7. Percentual de genes associados aos pares entre 96 cepas de Pasteurella multocida analisadas * em negrito: indica associação significativa (p<0.05) ** em negrito: indica associação significatava (p<0.001) Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)

69 ompHtoxAptfAnanH exbD- tonB sodApfhAhgbAsodCnanBhgbBoma87hsf-1furpmHASpsIompAplpBtadA ompH100 toxA1100 ptfA nanH93 * exbD-tonB 100 * * 100 sodA pfhA hgbA * * 100 sodC * nanB100 * * * 100 hgbB * oma87100 hsf-136 * * * fur99 * * * * 100 pmHAS * * psl99 * * * * 99 * ompA77 * * * * 7539 ** 77 * plpB100 * * 100 ** * * * 100 tadD * * ** 5728 * 59 * 62 * 5974 * Tabela 7. Percentual de genes associados aos pares entre 96 cepas de Pasteurella multocida analisadas * em negrito: indica associação significativa (p<0.05) ** em negrito: indica associação significatava (p<0.001) Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014) Houve associação significativa na combinação da presença dos genes de virulência em 45 situações.

70 cólera aviária saúde animal Habitante normal das vias aéreas (MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012) ? ? ? ?

71 cólera aviária saúde animal Habitante normal das vias aéreas (MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012) ? ? ? ? A bactéria é patogênica?

72 ? BIOVAR 3 BIOVAR 13 multocida septica gallicida BIOVAR 2 A:1 A1:3 sorogrupo D cápsula tipo F colônia iridescente pfhA + hgbA + toxA + hgbB + Β-hemólise fur nanH

73 Dendrograma com a relação de cepas de P. multocida conforme o perfil de virulência Genoma Pm70 Alinhamento e comparação da sequência de aminoácidos da proteína OmpH da cepa P52 com diferentes sorotipos de P. multocida Utilização da inoculação de animais para determinar a patogenicidade dos isolados (Ibrahim et al., 1998; Shivachandra et al., 2006; Mohamed et al.,2012) raros variáveis quanto ao padrão de avaliação Lei (08/10/08) Procedimentos para o uso científico de animais

74 estabelecer um modelo de classificação da patogenicidade de P. multocida a partir da inoculação de pintos de corte. Estabelecimento de um índice de patogenicidade em pintos de corte de um dia de idade para cepas de Pasteurella multocida isoladas de de aves e de suínos. Parâmetros avaliados 1.tempo de morte (dias): observação das aves por 07 dias 2. presença de lesões macroscópicas (Pilatti, 2014) A BC DE F A) aerossaculite B) Lesão local aplic. C) onfaliteD) pericardite E) perihepatite F) peritonite

75 * TM: Tempo de Morte; PC: Pericardite; PH: Perihepatite; PT: Peritonite; ASS: Aerossaculite; LA: local de aplicação; ONF: Onfalite; (Pilatti, 2014) IP = ∑(IPI) N Cálculo do Índice de Patogenicidade Individual (IPI) para cada animal Dia de MorteTM TM x 5 Somatório do Escore de Lesões (EL) N° de LesõesValor ,000 20,85724,28654,165 30,71443,57143,333 40,5712,85732,500 50,42842,14321,667 60,28571,42810,833 70,14280,71400,000 7*00 *** * IPI = TM x 5 + (PC + PH + PT + ASS + CL + ONF) Tabela 8. Relação entre o tempo de morte ou o número de lesões e o respectivo valor atribuído Cálculo do Índice de Patogenicidade Individual (IP) para a cepa inoculada 10 aves p/ cada cepa (Souza, 2010) somatório escore de lesões Fator de bonificação de sobrevivência: 0,1428

76 CepaIPCepaIPCepaIPCepaIPCepaIPCepaIP ,80 496,11 654,44812, ,18 347,75505,81 664,43822, , ,69 515,63 674,39832, ,93 367,69525,46 683, ,87377,5535,44 693,89851, ,6938 7,57 545,26703,79861, ,639 7,44 555,24713,60871, ,51 407,25 565,17723,5881, ,44 417,20 575,07733,31891, ,2742 6,93 584,93743,27901, ,26 436,77 594,89753,12911, ,13446,65 604,88762,99921, ,06 456,56 614,80772,6931, ,93 466,43 624,73782,5941, ,90 476,42 634,69792,42951, ,82 486,31 644,56802,29960,17 Tabela 9. Valores dos Índices de Patogenicidade (IP) das 96 cepas de Pasteurella multocida inoculadas em frangos de corte com 01 dia idade Classificação de PatogenicidadeN° de AmostrasMediana ± DP Alta (8-10)379,13 ± 0,953 ᵃ Intermediária (4-7)355,24 ± 1,159 ᵇ Baixa (0-3)241,75 ± 0,837 ᶜ Tabela 10. Mediana dos valores dos Índices de Patogenicidade (IP) de acordo com a distribuição das cepas de Pasteurella multocida nos grupos de patogenicidade Letras diferentes na mesma coluna representam diferença estatística significativa (p<0,01) (Pilatti, 2014) Kruskall-Wallis test

77 Redes Neurais Artificiais Explicar, simular e predizer os resultados zootécnicos da cadeia avícola; Gerenciamento de reprodutoras pesadas Gerenciamento de frangos de corte Gerenciamento de matadouros- frigoríficos de aves Guahyba, 2001Realli, 2004Pinto, 2006 Spohr, 2010 Gerenciamento da cadeia avícola Explicar, simular e predizer os resultados em temas sanitários da cadeia avícola; Avaliação da depleção linfocitária da Bursa de Fabricius Moraes, 2008 Avaliação da depleção linfocitária do timo Carvalho, 2013 Classificação da patogenicidade de Escherichia coli Rocha, 2006; Tejkowski, 2013 Classificação da resistência antimicrobiana de Escherichia coli Salle, 2009; Da Rocha, 2012

78 Redes Neurais Artificiais Simula em computadores o funcionamento do cérebro humano implementando modelos matemáticos que se assemelhem às estruturas neurais biológicas; (FERNEDA, 2006) RNAs calculam funções matemáticas normalmente não lineares e estão dispostas em uma ou mais camadas interligadas por um grande número de conexões associados a determinados pesos conforme as informações de entrada recebidas. (BRAGA et al., 2000; LUDWIG & COSTA, 2007) dendritos sinapses

79 Presença de 22 genes de virulência Classificação do índice de patogenicidade das cepas Redes Neurais Artificiais Alta Intermediária Baixa Camada de entradaCamada de saída

80 Programa Neuroshell Classifier 2.1

81 Alternativa para determinação da patogenicidade sem a utilização de modelos animais

82 Obtenção de amostras isoladas em outros hospedeiros (ruminantes, suínos, pets); Possibilidade de transmissão horizontal de genes de virulência (DAVIES et al., 2004; BETHE et al., 2009) Comparação perfis genéticos e tipificação molecular (ZAGLIC et al., 2005; SUBAAHARAN et al., 2010) Amostras isoladas de animais sadios e doentes Amostras de diferentes origens CA na forma aguda CA na forma crônica Os genes toxA, tbpA e pfhA: marcadores do potencial patogênico em outras espécies (DAVIES et al., 2004; BETHE et al., 2009)

83 Obrigado pela atenção.


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