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ESPECTROFOTOMETRIA CROMATOGRAFIA ELETROFORESE MÉTODOS BIOFÍSICOS DE SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES DE UMA SOLUÇÃO BIOLÓGICA.

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1 ESPECTROFOTOMETRIA CROMATOGRAFIA ELETROFORESE MÉTODOS BIOFÍSICOS DE SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES DE UMA SOLUÇÃO BIOLÓGICA

2 As soluções biológicas, além da água (solvente), possuem um número enorme de componentes (íons, pequenas moléculas, glicose, uréia, creatinina, colesterol, lipídios complexos...). Estudar a composição quantitativa e qualitativa desses sistemas é indispensável. Os métodos biofísicos permitem separar e identificar esses componentes.

3 1- ESPECTROFOTOMETRIA POR MEIO DA ESPECTROFOTOMETRIA, COMPONENTES DESCONHECIDOS DE UMA SOLUÇÃO PODEM SER IDENTIFICADOS POR SEUS ESPECTROS DE COR

4 É o método óptico mais usado nas investigações biológicas e físico-químicas. Método colorimétrico que permite detectar a concentração de compostos presentes em uma solução. A energia utilizada é a luminosa – se baseia na absorção da luz pelo composto a ser medido Por meio da espectrofotometria, componentes desconhecidos de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos

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6 O olho humano percebe cores entre as faixas de 400 a 750 nm

7 ABSORÇÃO DA LUZ A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de partícula (fóton) A interação da luz com a matéria depende da estrutura química dos compostos Compostos corados – cromóforo Reagente cromogênico A reação entre o composto cromóforo e o reagente cromogênico origina um produto colorido – quanto mais concentrado – maior quantidade de luz ele absorve

8 A espectrofotometria consiste em: Usar o espectro radiante (luz) para inspecionar sistemas biológicos, principalmente soluções. Um feixe de energia atravessa a solução e a sua absorção oferece informações sobre a qualidade e quantidade dos Componentes do sistema Luz Monocromática: É a luz utilizada em experiências e em medidas espectrofotométricas É aquela de um único comprimento de onda

9 Método de espectrofotometria De absorção - É o processo fundamental -Passagem de um feixe de luz pela solução e mede-se sua absorção Aparelho utilizado é o espectrofotômetro que deve produzir a luz MC e medir a luz absorvida pelas soluções.

10 Curva de absorção espectral permite: Identificar substâncias - são uma “impressão digital” Identificar grupamentos químicos Identificar a pureza de substâncias - quando a curva se afasta do esperado Identificar os comprimentos de onda para dosagem da substância - escolher comprimento de onda que seja especificamente absorvido por aquela substância

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12 Determinação da concentração da substância É um dos métodos mais sensíveis e precisos Quanto mais choques entre o feixe de energia e a matéria absorvente, mais energia é absorvida. É dependente de 2 fatores: Trajeto óptico Concentração Quando a concentração da substância é constante, a absorção depende do comprimento do trajeto óptico. E quando o trajeto óptico é constante, a absorção dependerá da concentração

13 2 - CROMATOGRAFIA Método de separação e identificação de componentes dos sistemas biológicos (misturas) que consiste em movimentar o sistema, em condições apropriadas e separar espacialmente os componentes: a cada componente uma posição no trajeto. As substâncias vão se movimentar pelo sistema em velocidades diferentes e se separarem

14 Ocorre pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. Esses sistemas podem ser: sólido –líquido ou sólido-gás A fase líquida é a móvel, solvente A fase sólida é a fixa, suporte ou matriz Analito: substância a ser analisada após separação

15 A cromatografia é um dos métodos de análise que tem grande utilização devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas É uma técnica que separa os componentes por diferença de peso molecular, carga iônica e afinidade. A cromatografia pode ser feita de vários modos, os mais comuns são: em colunas e em placas

16 Métodos cromatográficos Cromatografia de adsorção Adsorção é a adesão física ou ligação de íons e moléculas na superfície de uma outra molécula. Cromatografia em Camada Delgada Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas) As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.

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18 Aplicabilidade na indústria farmacêutica Controle de qualidade de ativos e formas farmacêuticas: Determinação da porcentagem do princípio ativo, Quantificação das impurezas de um produto, Determinação da composição ou formulação de um produto Estudo de estabilidade e degradação de um produto Vantagens: Alta precisão, curto espaço de tempo (1 a 20 minutos) - Métodos mais utilizados: Cromatografia líquida (água, metanol, acetonitrila...) Cromatografia gasosa (He, N2...)

19 3- ELETROFORESE É a separação de componentes de um sistema através da aplicação de um campo eletromagnético Permite a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas O princípio básico consiste na migração de substâncias de acordo com suas cargas elétricas: - Componentes de carga negativa migrarão para o polo positivo - Componentes de carga positiva migrarão para o polo negativo

20 Deve-se levar em conta, além das cargas elétricas o peso molecular das partículas a serem separadas: Quanto maior o peso molecular, mais lenta será a migração da partícula pelo gel e menor será a distância percorrida por ela

21 Fatores que condicionam a migração eletroforética A velocidade de migração das partículas vai depender dos seguintes fatores: Força do campo aplicado Carga, tamanho e forma das moléculas Viscosidade, pH e temperatura do meio A voltagem aplicada ao sistema deve ser adequada: Deve ser o mais rápido possível, para evitar que os componentes se difundam e se espalhem no sistema Não pode ser muito alta, pois superaquece o sistema, prejudicando a separação dos componentes

22 Métodos de eletroforese EM GEL: - O mais usado é a poliacrilamida Filtração pelos poros do gel (separa por tamanho da molécula), além da separação por cargas EM GEL DE POLIACRILAMIDA COM SDS: Proteínas são tratadas com sódio-Duodecil-Sulfato para igualar suas cargas (negativas) Serão separadas pelo peso molecular As mais leves chegarão primeiro ao polo positivo

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26 Aplicabilidade prática Estudo clínico do plasma: - Separação de proteínas no plasma ou no soro (mostra alterações peculiares de algumas patologias) Há um elevado número de proteínas identificadas no soro, que diferem entre si estruturalmente e participam em vários processos fisiológicos. - A análise das proporções de suas frações tem considerável valor na abordagem de desordens agudas e crônicas, fornecendo informações clinicamente úteis.

27 Análise de DNA – teste de paternidade Gel de agarose ou poliacrilamida Em placa vertical A amostra colhida é trabalhada para que haja fragmentação das tiras de DNA As amostras são misturadas a um corante (bromofenol) leitura luz UV

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