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"Compostos Bioativos de Plantas Medicinais e Uso como Marcadores em Fitoterápicos: Perspectivas e Desafios" Profa. Dra. Tania M. B. Bresolin Universidade.

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1 "Compostos Bioativos de Plantas Medicinais e Uso como Marcadores em Fitoterápicos: Perspectivas e Desafios" Profa. Dra. Tania M. B. Bresolin Universidade do Vale do Itajaí- UNIVALI, Itajaí-SC, Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Ilhéus – BA 27-30/10/2014

2 (BRASIL, 2014 – RDC 26): São considerados MF ou PTF os obtidos com emprego exclusivo de matérias primas ativas vegetais. Não é considerado fitoterápico aquele que inclua na sua composição substâncias ativas isoladas ou altamente purificadas, sejam elas sintéticas, semissintéticas ou naturais e nem as associações dessas com outros extratos, sejam eles vegetais ou de outras fontes, como animal. São caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. BRASIL. ANVISA. RDC N° 26, DE 13 DE MAIO DE 2014, D.O.U. 14/05/14. Medicamento Fitoterápico (MF) e Produto Tradicional Fitoterápico (PTF)

3 Marcadores European Medicines Agency (EMA). Guideline on specifications: test procedures and acceptance criteria for herbal substances1, herbal Preparations and herbal medicinal products /traditional herbal medicinal products, EMA/CPMP/QWP/2820/00 Rev. 2, 31, March Substância ou classe de substâncias (ex: alcaloides, flavonoides, ácidos graxos, etc.), utilizada como referência no controle da qualidade da matéria- prima vegetal e dos fitoterápicos, preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico (BRASIL, 2014). Existem duas categorias de marcadores: I - Marcadores ativos: quando o constituinte ou grupo(s) de constituintes tem relação com o efeito terapêutico (Ex: Senosídeos -Senna alexandrina; Silimarina - Silybum marianum; Kavalactonas - Piper methysticum; Escina - Aesculus hippocastanum; Hipericinas - Hypericum perforatum; Flavonoides - Crataegus oxyacantha e Ginkgo biloba; II - Marcadores analíticos: quando ainda não foi demonstrada a relação do constituinte ou grupo(s) de constituintes com a atividade terapêutica do fitocomplexo (Ex.: Ácidos valerênicos -Valeriana officinalis; Echinacosídeos - Echinacea purpurea; Derivados do ácido cafeoilquínico - Cynara scolymus) BRASIL. ANVISA. RDC N° 26, DE 13 DE MAIO DE 2014, D.O.U. 14/05/14. A seleção de marcador entre ativo e analítico sempre deve ser justificada tecnicamente

4 -Complexidade da composição – elevado número de componentes que pertencem a diferentes classes químicas -Desafio analítico - diferentes comportamentos analíticos -concentrações muito baixas – especialmente no fitoterápico -Estabilidade dos componentes Perfil cromatográfico x Doseamento de marcadores Droga Vegetal, Derivado Vegetal (Produtos intermediários) e Fitoterápico (Produto Acabado)

5 Características (in)desejáveis - Marcadores European Medicines Agency (EMA). EMA/HMPC/41500/2010 Rev.2. Questions & answers on quality of herbal medicinal products/traditional herbal medicinal products. May Mais específico possível para a droga ou derivado vegetal; -indicativos da estabilidade x instável em condições normais de utilização ("ferramenta analítica pobre"); -baixas concentrações \ ausência de cromóforo – dificuldade de detecção em métodos cromatográficos usuais; -grupos de constituintes estruturalmente relacionados – dificuldade na separação; -geralmente são metabólitos secundários (flavonóides, saponinas, terpenos, fenóis etc); -metabólitos primários (carboidratos, aminoácidos / proteínas, gorduras, etc; ex.:carboidratos em linhaça, ácidos graxos no saw Palmetto).

6 Legislação Europeia Guideline on Quality of Herbal Medicinal Products / Traditional Herbal Medicinal Products (CPMP/QWP/2819/00, rev 1) - Extratos padronizados - Extratos quantificados - "Outros" extratos Extratos padronizados: são ajustados para atingir um teor declarado de constituintes com atividade terapêutica conhecida (exemplo: silimarina em Silybum marianum). Portanto, extratos padronizados são geralmente tratados da mesma maneira como IAFs quimicamente definidas, incluindo, por exemplo, os ensaios de dissolução para as formas orais sólidas. Extratos quantificados: são ajustados para atingir um faixa definida de componentes ativos (exemplo: Hipericinas totais em Hypericum perforatum). Outros extratos: não há componentes conhecidos relacionados com a atividade terapêutica, são essencialmente definido pelo seu processo de produção e suas especificações – relação Extrato:Droga Vegetal Bufaino, E.M. Phytotherapy in Brazil: recovering the concepts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 23 (1), 22-27, 2013.

7 Marcadores BRASIL. ANVISA. RDC N° 26, DE 13 DE MAIO DE 2014, D.O.U. 14/05/14. ANVISA. INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 4, DE 18 DE JUNHO DE marcadores são utilizados para fins quantitativos e qualitativos. -Os marcadores propostos fornecem uma importante ferramenta para correlacionar as drogas ou derivados vegetais no produto acabado, independentemente do fato desse marcador ter atividade terapêutica ou não. -No entanto, somente a presença dos marcadores dentro dos limites estabelecidos não assegura por si só a uniformidade lote a lote, sendo necessário apresentar outros testes, como o perfil cromatográfico; -o seu teor deve manter-se dentro de uma faixa estável tanto na matéria-prima como no produto final

8 Escolha dos marcadores - Revisão da literatura; - Monografia de farmacopéias e “drafts” de monografia (Pharmeuropa); - Viabilidade analítica do marcador na droga vegetal e no medicamento; - Adequação do marcador para estudos de estabilidade; - Substâncias de referência: disponibilidade, qualidade e custos.

9 Escolha dos métodos Nos casos em que forem utilizadas técnicas cromatográficas que não detectem todo o perfil de constituintes característicos da espécie, será exigido, em complementação, outros métodos de análise, como o perfil por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) (RDC 26, 2014) Perfil Cromatográfico -objetivos e reprodutíveis; -adaptados às características dos componentes que são alvos das determinações; -seletivos o suficiente para separar os componentes que, tanto quanto se sabe, são característicos da espécie vegetal; -suficientemente gerais para o perfil do máximo de componentes possíveis (ex.: observar em vários comprimentos de onda); -robustos o suficiente para assegurar que os componentes lábeis ou instáveis sejam identificados, em especial quando a estabilidade de uma substância é preocupante; -otimizados para produzir perfis cromatográficos de alta qualidade. ANVISA. INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 4, DE 18 DE JUNHO DE 2014.

10 Estabilidade - droga vegetal ou o derivado vegetal, na sua totalidade, é considerado como a substância ativa - não será suficiente, uma simples determinação da estabilidade dos marcadores; - A estabilidade das outras substâncias presentes deve, na medida do possível, também ser demonstrada, por exemplo, por meio de impressão digital de cromatogramas adequados. Comparar o perfil cromatográfico no início e fim do estudo de estabilidade EMA/CPMP/QWP/2819/00 Rev. 2. Guideline on quality of herbal medicinal products1/traditional herbal medicinal products, 2011.

11 Estabilidade * European Medicines Agency (EMA). Guideline on specifications: test procedures and acceptance criteria for herbal substances1, herbal Preparations and herbal medicinal products /traditional herbal medicinal products, EMA/CPMP/QWP/2820/00 Rev. 2, 31, March Specifications: profile and stability of the constituents* -herbal substances (droga vegetal) -herbal preparations (derivados vegetais) -herbal medicinal products (fitoterápicos) Assay: In the case of HS, HP or HMP with constituents of known therapeutic activity or with active markers, assays of their content are required with details of the analytical procedure. Where possible, a specific, stability-indicating procedure should be included to determine the content. In cases where use of a non-specific assay is justified, other supporting analytical procedures may be used to achieve overall specificity if required.

12 Métodos Indicativos de Estabilidade (MIE)– Stability-Indicating Assay Methods (SIAM) FDA - Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation * FDA - Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation. Draft Guidance., August Stability-Indicating Assay Um ensaio indicativo de estabilidade mede com precisão e exatidão os ingredientes ativos, sem interferência dos produtos de degradação, impurezas do processo, excipientes ou outras impurezas potenciais; Um ensaio indicativo de estabilidade é um processo analítico quantitativo validado que pode detectar as alterações com o tempo das propriedades relevantes da droga vegetal e do fitoterápico; Procedimentos analíticos para estudos de estabilidade devem ser indicativos de estabilidade, a menos que seja justificada cientificamente. -Um método não MIE pode considerar um produto não estável como sendo estável.

13 BLESSY, M.; PATEL, R. D.; PRAJAPATI, P. N.; AGRAWAL, Y. K. Journal of Pharmaceutical Analysis, v. 4, n. 3, p. 159–165, Estabelecer vias de degradação; Diferenciar os produtos de degradação que são relacionados ao fármaco daqueles que são gerados a partir de outros componentes numa formulação; Elucidar a estrutura dos produtos de degradação; Determinar a estabilidade intrínseca da substância ativa na formulação; Revelar os mecanismos de degradação como hidrólise, oxidação, termólise ou fotólise; Estabelecer a capacidade indicativa de estabilidade de um método desenvolvido; Compreender as propriedades químicas dos fármacos; Produzir um perfil de degradação semelhante ao do que seria observado em um estudo de estabilidade formal; Gerar formulações mais estáveis ​​ ; Resolver problemas relacionados com a estabilidade. ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA

14 Métodos Indicativos de Estabilidade (MIE)– Stability-Indicating Assay Methods (SIAM) * Visweswara Rao K, Reddy KP, Kumari KS, Srinivas M.. A stability indicating HPLC method for determination of Bazedoxifene acetate and its related substances in active pharmaceutical ingredient. Journal of Chromatographic Science Mar;51(3): Visweswara Rao KReddy KPKumari KSSrinivas M

15 Métodos Indicativos de Estabilidade (MIE)– Stability-Indicating Assay Methods (SIAM) LC-UV - Mais indicado para validação de MIE -A maior parte dos fármacos absorve no UV/Vis -Possível obter a pureza do pico (com restrições) -Injeção da amostra em temperatura ambiente -Quantificação em percentagem de área dá bons resultados -Compatível com tampões não voláteis. * Edivan Tonhi. Bioagri Laboratórios Ltda. -Possível co-eluição de compostos com mesmo perfil no UV; -Baixas concentrações (aquisição do espectro em regiões próximas da linha base) -os produtos de degradação podem não absorver no UV Técnicas de monitoração de testes de degradação forçada

16 BLESSY et al., 2014  Condições de degradação Tanto as diretrizes impostas pelo ICH, quanto as normas brasileira solicitam a realização de estudos de degradação forçada sob uma variedade de condições, como pH, luz, oxidação, aquecimento, etc., mas não fornecem detalhes sobre técnicas práticas envolvendo os testes de estresse A escolha das condições de degradação deve ser consistente com a sua decomposição em condições normais de fabricação e armazenamento

17 Métodos Indicativos de Estabilidade (MIE)– Stability-Indicating Assay Methods (SIAM) KLICK, S.; MUIJSELAAR, P. G.; WATERVAL, J.; EICHINGER, T.; KORN, C.; GERDING, T. K.; DEBETS, A. J.; DE GRIEND, C. S.; SOMSEN, G. W.; DE JONG, G. J. Towards a generic approach for stress testing of drug substances and drug products. Pharmaceutical Technology, v. 29, n. 2, p , condições drásticas - produtos de degradação de segunda e terceira geração i.Deve conduzir à degradação do composto principal, mas não mais do que 5-15% ii.Deve levar a uma boa previsibilidade dos processos de degradação (ou seja, uma baixa probabilidade de degradação "drástica" ou "falsa") iii.Deve ser conduzido por um período não superior a três meses Requisitos para condições de estresse: Estudos de estresse Como e quanto degradar?

18 1)Conhecer as características dos analitos Etapas para o desenvolvimento do MIE BAKSHI, M.; SINGH, S. Development of validated stability-indicating assay methods – critical review. J. Pharm. Biomed. Anal. v. 28, p , ) Estudos preliminares de separação nas amostras degradadas -Número e tipo de produto de degradação -Iniciar com C 18 – 25 cm -Iniciar com FM água:metanol ou água:acetonitrila – importante se for usar LC preparativa ou LC-MS -Analisar em diferentes, observar o aparecimento de coloração na amostra 3) Desenvolvimento do método e otimização -Usar detectores diferentes se possível – co-eluição? -Otimizar a FM, fluxo, temperatura, tipo de solvente, FE, etc 4) Identificação e caraterização dos produtos de degradação -Técnicas hifenadas -método tradicionais 5) Validação do MIE

19 VALIDAÇÃO ANALÍTICA ANVISA, ICH, FDA  Linearidade  Faixa ou intervalo  Especificidade/seletividade – Métodos indicativos de Estabilidade  Exatidão – placebo (ausente em matriz vegetal), spiking (analito com a mistura de produtos de degradação)  Precisão- transferência de métodos (interlaboratorial)  Limite de quantificação e identificação  Robustez

20 Aleurites moluccana L. Wild Extrato seco (folhas) spray dryer Teor de swertisina (pico 9): 2,5-3,1 mg/g, em base anidra Teor de fenólicos totais (picos 1-9) expressos em swertisina: 30,4-37,2 mg/g, em base anidra Teor de 2-O”-ramnosil swertisina (pico 8) expressos em swertisina: 16,8- 20,5 mg/g, em base anidra Cesca, T. G. ; Block, L.C. ; Machado, M.S.;; WitkowskI, C. ; Meyre-Silva, C. ; Souza, M. M. ; Quintao, N. L. M. ; Lucinda, R.M ; Silva, D. B. ; Fernandes, E. ; Ferreira, L. S. ; Lopes, N. P. ; Cechinel Filho, V. ; Bresolin, T.M.B. Validation of Stability Indicating HPLC method for the major flavonoids in the of spray dryer leaf extract of Aleurites moluccana L. Willd. Current Pharmaceutical Analysis,v. 11, , UNIVALI-EUROFARMA

21 72h luz Vis Degradação 2”-O ramnosil swertisina a)1,0% b)1,0% c) +26% d) 6,8% e) 2,6% a 72h HCl 3M b50h NaOH 1M c 48h H 2 O 2 3% d48h H 2 O refluxo e Cesca, T. G. ; Block, L.C. ; Machado, M.S.;; WitkowskI, C. ; Meyre-Silva, C. ; Souza, M. M. ; Quintao, N. L. M. ; Lucinda, R.M ; Silva, D. B. ; Fernandes, E. ; Ferreira, L. S. ; Lopes, N. P. ; Cechinel Filho, V. ; Bresolin, T.M.B. Validation of Stability Indicating HPLC method for the major flavonoids in the of spray dryer leaf extract of Aleurites moluccana L. Willd. Current Pharmaceutical Analysis,v. 11, , 2012.

22 EQUIPE – PROJETO PRONEM-FAPESC

23 UNIVALI

24 Balneário Camboriú-SC

25 Profa. Dra. Tania M. B. Bresolin Universidade do Vale do Itajaí- UNIVALI, Itajaí- SC, Brasil “Se quiser chegar rápido vá sozinho, se quiser ir longe vá acompanhado....” OBRIGADA PELA ATENÇÃO!


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