PROGRAMA FRANCO-BRASILEIRO DE AIDS Fortaleza – CE, 22 a 24 de Novembro de 2006. G enotipagem HIV & Resistência Laboratoire de Microbiologie Centre Hospitalier.

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1 PROGRAMA FRANCO-BRASILEIRO DE AIDS Fortaleza – CE, 22 a 24 de Novembro de 2006. G enotipagem HIV & Resistência Laboratoire de Microbiologie Centre Hospitalier & Universitaire Saint Louis –Paris francois.simon@sls.aphp.fr Laboratoire associé au Centre National de Référence du VIH au Centre National de Référence du VIH

2 Estudos de genotipagem visando os marcadores de progressão de resistência ou da progressão da aids Marcadores de progressão relacionados com a diversidade do HIV avaliação da replicação : cargas virais e reservatorio Resistência : testes, algorithmo e consequencia

3 HIV = HIV-1 : 3 groupos, - 11 sob-typos HIV-2 : 7 groups HIV-2 HIV-1 Major M HIV-1 N Gorilla Chimpanzee HIV-1 group O Mangabey

4 Diversidade Genetica dos HIV - HIV-1 groupo Major - HIV -2 : 7 groupos A-G (Africa lusofone) - groupos N (non-M/non-O) et O (outlier) : algumas cepas altement divergentes (Africa central ) CRFs (Circulating Recombinant Form) CRF01_AE = antigo sous-type E (Asia) CRF02_AG = IbNg-like (Africa do l’oeste, Franca, Portugal, Brasil CRF03_AB, CRF04_cpx …

5 non-B em Franca< 1996 : 10 % > 1996: 21 % > 2006 : 50% subtipo B : ainda predominante homo/bisexual subtipo non -B : 87% contaminação hétérosexual, CRF02 +++ Diversidade molecular dos HIV na Franca - 2005 3% dos novos casos = HIV-2 : Resistência natural no INRNT, T20 menor sensibilidade nos IP = HIV-O : Resistência natural no INRNT Laboratoire associé au Centre National de Référence du VIH au Centre National de Référence du VIH

6 Sub-tipo non B do HIV-1 Origine geografica dos pacientes CNR du VIH et InVS, données du 31/03/05 2003-12003-22004-12004-2

7 Diversdade molecular dos HIV na Franca Transmisso de cepas HIV-1 – Diversídade molecular dos HIV na Franca Transmiss ã o de cepas HIV-1 – resistênte ao TARV -- VIH-1 323 pacientes primo- infecção ANRS 2005 HIV-1 subtipo B = 12.3%. HIV-1 non B = 9.4 % ITRN 6% ITRNN 6% IPs 3%

8 Casseb et al 98, USP 108 HIV-1 B : two major V3 motifs, GPGR and GWGR = B brasielero Artur Ramos et UFRJ Al EID F + B, F + D, B + D Bongertz et al 2000, Brazilian Network HIV characterization. B (in 83 % of the samples), F (14 %), and C (3%) Couto-Fernandes JC 2006 : B, F, D, CRF02, C Diversdade molecular dos HIV no Brasil e consequencias Diversídade molecular dos HIV no Brasil e consequencias

9 Declínio da carga viral HIV e contagem CD4 um grupoO depletion CD4 no HIV crônico é -- Como um grupo -- na maior parte attribuable ao efeito direto do replication do HIV Mellors et AL, Science 1996

10 - 1512 pts US cohorts ao menos 6 meses taxa da perda CD4 predisse por níveis do RNA de plasma HIV diminuições medianas dos CD4 entre participants com vários níveis do RNA : - 501 to 2000 copies/mL 39 cells/mm3; - 10,001 to 40,000 copies/mL :56 cells/mm3; - > 40,000 copies/mL 78 cells/mm3 Declínio da carga viral HIV e contagem CD4 Rodriguez et al. JAMA. Sept 27, 2006

11 Carga viral refletiu por níveis do plasma não é a determinante principal da cinetica do declino dos CD4 no nível individual Carga viral elevada e SIV non pathogenic HIV-2: carga viral baixos e AIDS Rodriguez et al. JAMA. Sept 27, 2006 Declínio da carga viral HIV e contagem CD4

12 Declínio da carga viral ARN e ADN HIV e contagem CD4 ( C. Rouzioux et Al 2005) % de AIDS a 5 anos

13 Carga Viral e diversidade HIV - PCR sujeito aos riscos da diversidade dos VIH - A utilização de sondas bem escolhidas reduz o problema - Necessidade de vigilância +++ Importância de harmonizar os testes Expressão em UI

14 Sub –tipo B N=7 Sub –tipo A- CRF01 N=16 CRF02 N=49 CRF Outros N=16 Abbott Real time – Monitor -0.005-0.060.250.05 Monitor – TaqMan Roche 0.150.170.240.33 Abbott – TaqMan Roche 0.20.40.570.41 Carga viral e REAL TIME PCR Comparação Abbott e TaqMan Roche Mediane das differences em Log

15 Carga viral HIV e Resistência A monitoração viral da carga fica fondamental pele evaluaçao da resposta no TARV HIV-1 –O melhor marcador para o emergence de cepas HIV-1 – resistênte ao TART

16 Virus do Plasma HIV † † † 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10,000 100,000 1,000,000 reservatório viral Ongoing Tempo (anno) Plasma HIV-1 RNA (copias/mL) Limite de deteccçao (50 copias/ mL)

17 Limit of detection 0.001 0.1 10 1000 100,000 0123 Release from stable reservoirs Plasma HIV-1 RNA (copies/mL) Inicio TARV Stop TARV Impacto do tratamento no reservatório viral latente

18 Pressões seletivas da terapia Seleccçao dos quasispecies Drogas inadequadas Potencia inadequada Supressão Incomplete Resistência pre- TARV Adherence inadequate Viral load Time Drug-susceptible quasispecies Drug-resistant quasispecies Tratamento

19 Barreira genética baixa Mutação isolada Selecção rápida de mutantes ITRNN, 3TC Barreira genética elevada Várias mutações podem ser necessárias para provocar uma resistência Classe da IP Selecção de mutantes resistentes

20 Resistência : Testes in vitro Genotypagem – detectar os Mutaçãoes conhecidos Phenotypagem –Abilidade de um vírus selvagem ou recombinant para crescer em concentrações diferentes de ARV “Virtual” phenotypagem –Uso de resultados do genotype para predizer o susceptibilidade phenotypica com uma base de dados - genotypos e phenotypos

21 Vantagens e desvantagens do genotype Vantagens rápido « barato « sensível para detectar misturas resistente Tipagem do vírus Desvantagens Medida indireta, incapaz de detectar os variants minor padrões complexos do Mutaçãoal podem ser difíceis de interpretar

22 Vantagens e desvantagens do Phenotype Vantagens medida quantitative da resistência pode ser aplicada a todo o agente antiretroviral, including as drogas novas pode avaliar interações entre os Mutaçãoes exatos com subtypes, type, groupo HIV Desvantagens cutoff não definidas para alguns agentes Carissimo

23 Susceptibility Phenotypic: Relacionamento entre a concentração da droga e a inibição viral Inibição do replication do vírus (%) 50 0 100 resistance Wild-type IC 50 Resistant IC 50 Wild-type Resistant Concentração Da Droga

24 Vantagens e desvantagens do “Virtual” Phenotype Testing Vantagens Poderai dar uma visão da atividade parcial das droguas Desvantagens Confiabilidade dependerá da exatidão do genotype Valor da ligaçao genotype e dados phenotypicos ?? Mais caro

25 consequencias da resistencia do HIV / TARV : 679 pacientes - Resistência genotypic a qualquer classe de drogas antiretroviral observados em 53 assuntos (8%). - Emergence de resistência associado com o mortalidade aumentado e mais elevadas com a resistência de NNRTI (HR 1.75; 95% CI 1.27-2.43) British Columbia Centre for HIV & San Francisco General Hospital

26 Randomized Controlled Trials GART –Genotype + expert advice (EA) vs standard of care (SOC) Viradapt –Genotype vs SOC Havana –Genotype vs EA vs genotype + EA vs SOC VIRA 3001 –Phenotype vs SOC RealVirfen –VirtualPhenotype vs phenotype ARGENTA –Genotype vs SOC; benefit at 12 weeks lost at 6 months; outcome related to adherence NARVAL –Genotype or phenotype vs SOC; no difference at 12 weeks; highly experienced pts CCTG 575 –Phenotype vs SOC; no benefit at 6 or 12 months due to excellent performance of SOC CERT –Phenotype vs genotype vs SOC Estudos PositivosEstudos Negativos/Equivocal

27 Número dos Mutaçãoes entre um set de 9 Mutaçãoes : L10I, V32I, M46I/L, I47V, I54V/L/M, G73S, V82A/F/T/I, I84V, L90M Mude no RNA do plasma HIV-1 (Log copies/ml) ) Resposta a APV de acordo com o número dos Mutaçãoes (in Narval trial )

28 CCTG 575 : Phenotype vs SOC 238 pacientes com IP, estável para > 6 meses No mês 6, a redução no RNA do HIV era 0.71 e 0.69 log10 copies/ml para PHENO e SOC A proporção com < 400 copias/ml (48%) era a mesma para ambos os grupos. Nenhuma diferença foi vista no mês 12

29 HAVANA Trial resuldados: Pacientes com RNA HIV <400 c/ml na semana 24 (ITT) Genotype sem Genotype Genotype sem Genotype Expert69 %49 % 59 % p = 0.002 sem Expert46 %36 %41 % 58% 42% 58% 42% Tural, 4th ICAAC 2000, p = 0.02

30 Impacto da resistência da linha de base no resultado do tratamento: Estudo do FTC Borroto-Esoda K, et al. CROI 2004. Abstract 672. Incidence of Virologic Failure (%) AnyNNRTINRTIK103N AnyNNRTINRTIK103N FTC + ddI + EFV n = 270 d4T + ddI + EFV n = 276 Without baseline Mutação With baseline Mutação Mutação type: Naive pts, baseline VL > 5000 copies/mL

31 Resposta no Tipranavir na semana 24 de acordo com o gene Mutaçãoes do protease  Percentage of patients 0.00150.0119<0.0001 P=

32 Algoritmos da interpretação da resistência genotypic HIV-1 O grupo da resistência AC11 de ANRS fornece algoritmos da interpretação genotypic da resistência das drogas anti- HIV-1(« REDAGEN Frances ») Algoritmos baseados na correlação entre Mutaçãoes da resistência da droga e o resultado virological atualizadas regularmente http://www.hivfrenchresistance.org/

33 NUCLEOSIDE AND NUCLEOTIDE REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS ANRS 2006

34 Padrões da resistência após a falha initial do ITRN K70E 41, 67, 7O, 210, 215, 219

35 TAMs : Dichotomous resistências ZDV ou d4T Fatores desconhecidos ZDV resistance Nível mais baixo Resistência mais alta ZDV TAMs emerge sequencialmente com regimens de ZDV- e de d4T-containing após M184V 6 identified: M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q/E/N/R 41L 210W 215Y 67N 70R 219Q

36 TAMs : Dichotomous resistências 41-210-215 resistência dos níveis mais elevados mais resistente ao outro NRTIs, including o tenofovir, menos sensitized/M184V Hypersusceptibilidade ao ITRNN 67-70-219 - resistência dos níveis mais baixos - menos cruz-resistente ao outro NRTIs -mais sensitized/M184V

37 O « caso » M184V M184V emerge ràpidamente nos regimens nonsuppressive que contêm 3TC ou FTC mas também a redução na capacidade do replication Aumenta a sensibilidade na ZDV, no d4T, no TDF; diminuições no ABC e ddI,

38 Abacavir & M184V, L74V, K65R ABV - M184V, L74V, e K65R se nenhum analogue do thymidine estiver no regimen - M184V e TAMs na presença de um analogue do thymidine

39 NON-NUCLEOSIDE REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS ANRS 2006 EFV: efavirenz, NVP: nevirapine, ETV (TMC125): etravirine Mutaçãoes com o signification incerto: K101H/N/P/Q

40 Resistência no NNRTI = Reduz Marcada A Resposta Do Tratamento Gallant JE, et al. N Engl J Med. 2006;354:251-260. 84 9 73 9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 TDF/FTC + EFVZDV/3TC + EFV No B/L NNRTI resistanceB/L NNRTI resistance % VL < 400 c/mL at Wk 48

41 NNRTIs: Mutaçãoes Importantes O mais comum: K103N, Y181C Estes conduzem também à resistência de NNRTI: L100I, V106A, V108I, Y188L, G190A/S, P225H Outras substituições nos loci pertos podem induzir a resistência de NNRTI

42 Conseqüências clínicas da resistência à NNRTIs –cruz-resistência extensiva de NNRTI entre drogas –nenhum impairment da capacidade do replication –Nevirapine quando o zidovudine ou o stavudine estão no regimen, o Mutação de K103N é selecionado preferivelmente –Subtipo C : V106M ++

43 PROTEASE INHIBITORS ANRS 2006

44 Vista geral da resistência do PI Mutaçãoes do PI podem ser limitada sem resistência transversal NFV: D30N ( L90M non subtipo B) –ATV: I50L –FPV: I50V ( reduz o susceptibility o LPV ) Resposta to ritonavir-boosted PI (LPV/r, FPV/r, SQV/r)

45 Vista geral da resistência do PI Major PI Mutaçãoes: M46I/L, V82A/F/T/S, I84V/A/C, L90M afetarão todo o PIs atual Minor PI Mutaçãoes: L10F/I/R/V, V32I, I54V/M/L Número crescente = resistência crescente, Em caso de grande número mutaçãoes PI phenotyping poderia ajudar ??

46 FUSION INHIBITOR ANRS 2006 T20 G36A/D/E/S/V V38A/E/K/M Q40H/K/P/T N42D N43D/H/K/S N42T + N43S L44M L45Q/M Resposta individual altamente variavel Complexidade da interpretaçao do genotipe

47 Dosagens plasmaticos dos ARV quociente inhibiteur –Ratio Cmin / CI50 ou CI90 –Cmin : concentration résidual plasma do IP –CI50-CI90 de l’IP : teste phénotypico réal ou virtual quociente Inhibiteur Génotypique (GIQ) –Ratio Cmin de l’IP / numero de mutaçãoes – critèrios Génotypiques de resistência Pharmacocinétique –Posologie individualizado –Valor preventivo sobre resposta virulógica ??

48 Relacionamento do quociente inhibitory à resistência da droga 0.01 0.1 1 10 CI 50 (wild-type HIV) Drug concentration (  g/mL) C trough 024681012 IQ (wild-type HIV) CI 50 (mutant HIV) Smaller IQ for mutant Time after dosing (hours)

49 HIV- 2 resistência genotypic ANRS 2006 NRTI Q151M : resistência d4T, ABC Q151M + M184V : resistência NRTI except TDF M184V : resistência 3TC/FTC NNRTI Naturalmente resistência natural a tudos os a NNRTI [3, 4] PROTEASE INHIBITORS resistência a APV e aos dados contradictory do fosAPV e para ATV FUSION INHIBITOR Naturalmente resistente a T20 [3, 4]

50 Limitações dos testes da resistência Falta de controles de qualidade uniformes através dos laboratórios diferentes O custo elevado Não pode ser executado com o RNA < 1000 copies Não pode poder detectar populações do vírus resistente < 20% reservatórios viral também não detectados

51 HIV Resistance Testing Using Dried Blood Spots (Plantier JC et Simon F Aids 2005) Coleção do plasma e do sangue secado num papel filtro dos pacientes HIV sendos da África Taxa do sucesso para genotyping Plasma: 100% Dried blood spots: 90 % Dried blood spots, Taxa do sucesso para amplification – VL > 5000 copies/Ml = 100% Concordance entre plasma and sangue secado sequences

52 As recomendações de prescrição de génotipagem de résistance infecção aguda e infecção récente (<1ano) recomendado Ao momento da descoberta Diagnostico recomendado Fahla terapêuticarecomendado Prophylaxia post expositionIndividualmente Gravidez *Antes da iniciação de 1 tratamento CriançasMesmas indicações que para o adulto

53 Resistência na prática clínica: Sumário - Genotype preferido Antes do Tratamento : infecção aguda ou crônica Fahla do TARV - Phenotype or combined phenotype/genotype en caso de alta resistência no NRTIs or PIs on genotype Falha múltipla do regimen com opções limitadas do tratamento