Título do Trabalho: Verificação da Atividade Lipolítica de Pseudomonas Isoladas das Lagoas de Tratamento de Dejetos de Suínos e de Efluentes de Abatedouros.

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1 Título do Trabalho: Verificação da Atividade Lipolítica de Pseudomonas Isoladas das Lagoas de Tratamento de Dejetos de Suínos e de Efluentes de Abatedouros de Frangos. Área de conhecimento: Engenharias. Autores: Elisa Helena Siegel Moecke (orientadora), Aline Ferreira Ali de Ávila (bolsista - Art. 170). Curso de Engenharia Ambiental-Campus Grande Florianópolis-Unidade Ponte do Imaruí Introdução A biotecnologia é uma das ferramentas tecnológicas da atualidade, tem contribuído nas mais diversas áreas, como agrícola, alimentícia, monitoramento de produtos de excreção e qualidade ambiental, além da produção de novos produtos para a indústria química e farmacêutica. Tecnicamente, o termo biotecnologia é o uso de sistemas biológicos, organismos vivos ou seus derivados para a produção ou modificação de produtos e processos para um uso específico. Muitos fungos e bactérias sintetizam e secretam enzimas, industrialmente úteis no processamento de uma variedade de materiais. Uma das enzimas produzidas por microrganismos é a lípase. Atua sobre a ligação éster de vários compostos, sendo os acilgliceróis seu melhor substrato. O uso de enzimas em processos tecnológicos, muitas vez, não é viável economicamente. Uma das formas de deixar o processo mais barato, é usá-las na forma imobilizada. Diversas espécies de Pseudomonas, entre as quais P. aeruginosa e P. putida isoladas do meio ambiente (em geral águas de esgoto), comprovaram em laboratório a bioprodução de enzimas lipolíticas (lipases). Objetivos Verificar a capacidade lipolítica das Pseudomonas isoladas de sistemas de tratamento de dejetos de suínos e de efluentes abatedouros de frangos, em sistemas de transesterificação visando a produção de biodiesel. Metodologia Os microrganismos utilizados neste projeto foram isolados por alunos de projetos de Iniciação Científica realizado em anos anteriores e que estão disponíveis no laboratório de Engenharia Ambiental – LEA da UNISUL. Estes microrganismos foram isolados a partir de amostras provenientes de sistemas de tratamento de dejetos de suínos – lagoa anaeróbica (Figura 1) e de sistemas de tratamento do tipo lagoa de decantação de efluentes de abatedouro de frangos. Os microrganismos isolados foram reativados utilizando o meio de Agar Cetrimide (AC) (figura 2) usando a técnica de estriamento em placa e incubadas a 37ºC durante 48h. Após o crescimento as colônias foram identificadas morfologicamente, pela técnica de coloração de Gram e também através de provas bioquímicas. Figura 1-Suinocultura localizada em Antonio Carlos-SC Figura 2-Meio Agar Cetrimide FONTE: AVILA,2010. FONTE: AVILA,2010 Fermentação Submersa Foram retiradas três alçadas da colônia caracterizada e transferidas para um Erlenmeyer de 250mL contendo 100mL do meio de crescimento (Figura 3), a 30ºC ±1ºC e sob agitação de 100rpm por 48h. Após este tempo foram retirados volumes de 1mL e 5mL da cultura (inóculo) para frascos Erlenmeyers de 125mL contendo 50mL do Caldo Adaptador, mantidos sob agitação de 100rpm por 24h e 48 h a 30ºC ±1ºC e após atuação da enzima extracelular (Figura 4) foi medido a atividade lipolítica das enzimas extracelulares por titulação dos ácidos graxos liberados com KOH 0,05N usando fenolftaleína como indicador (AOCS, 2002). Figura 3-Meio para crescimento s/ inóculo Figura 4-Meio de Crescimento após a atuação da enzima FONTE: LOFFI,2010. FONTE: LOFFI,2010 Foram realizados ensaios para avaliar a atividade catalítica de transesterificação das lípases extracelulares produzidas durante a fermentação submersa visando a produção de biodiesel. Resultados A Tabela 1 a seguir apresenta as características morfológicas dos microorganismos isolados das lagoas de dejetos de suínos e de efluente de abatedouro de frango. Tabela 1. Características morfológicas dos isolados. Na tabela 2 são apresentados os resultados dos testes de coloração de Gram e das provas bioquímicas: Catalase, Coagulase, Oxidase e Prova do Vermelho de Metila (VM) para os isolados selecionados. Tabela 2. Resultados dos testes de coloração de Gram e provas bioquímicas. Legenda: (+) resultado positivo para o teste realizado, (-) resultado negativo para o teste realizado. Na tabela 3 são apresentados os resultados da atividade lipolítica dos isolados. Tabela 3. Atividade lipolítica das bactérias isoladas utilizando o método da titulação dos ácidos Graxos liberados. As enzimas extracelulares produzidas pelas Pseudomonas, quando usadas como catalisadores nas reações de transesterificação, não foram eficientes para produção de biodiesel. Os valores de Rf obtidos durante a análise cromatográfica de camada delgada (CCD) ficaram abaixo de 0,45. Para que haja a formação de biodiesel o Rf deve estar na faixa de 0,6 e 0,7. Conclusões As 5 cepas caracterizadas quanto à morfologia, técnica de coloração de Gram e pelos testes bioquímicos de catalase, coagulase, oxidase e vermelho de metila tiveram resultados de acordo com a literatura no que se refere às características das bactérias pertencentes à família Pseudomonadaceae, e apenas a cepa IPS2 é do gênero Pseudomonas. A atividade lipolítica extracelular dos isolados variou de 0,001 a 0,92 U/mL. Os isolados que tiveram os maiores valores de atividade lipolítica foram as cepas IPS-3 e IPS-5. As cepas IPS-1 e IPS-2 apresentaram valores de atividade lipolítica menores que os encontrados por outros pesquisadores. As reações de transesterificação catalisadas pelas enzimas extraceluares produzidas pelo inóculo bacteriano não apresentaram valores de Rf que indicasse a formação de ésteres etílicos (biodiesel). Bibliografia AOCS. American Oil Chemists' Society. Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists' Society, 5º edition, Champaign, 2002. KAMINI, N. R.; FUJII, T.; KUROSU, T.; IEFUJI, H. Production, purification and characterization of an extracellular lipase from the yeast, Cryptococcus sp. S-2. Process Biochemistry, v. 36, n. 4, p.317-324, 2000. Apoio Financeiro: Unisul IsoladosMeioFormaBordosElevaçãoTamanhoPigmentaçãoAspectoSuperfície IPS-1Cetrimidecircularlisosplana2-3mmbrancaopacalisa IPS-2Cetrimidecircularinteirosconvexa3-4mmcremeopacalisa IPS-3Cetrimideirregularlobadosplana6mmamarelatranslúcidalisa IPS-4Cetrimidecircularlisosconvexa3-4mmbrancabrilhosalisa IPS-5Cetrimidecircularlisosplana2-3mmamarelaopacalisa IsoladosGramFormaCatalaseCoagulaseOxidaseVM IPS-1-bacilos+--+ IPS-2-bacilos+-++ IPS-3-bacilos+--+ IPS-4-bacilos+--+ IPS-5-bacilos+--+ Isolados Tempo de Reação / Volume de Inóculo Atividade lipolítca 24h/1mL U/mL 48h/1mL U/mL 48h/5mL U/mL IPS-10,1310,0180,023 IPS-20,026ND0,028 IPS-30,920,0300,001 IPS-40,34ND IPS-50,89ND