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Prof a Leila Larisa Medeiros Marques Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos.

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1 Prof a Leila Larisa Medeiros Marques Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos

2 Definição COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias constituído por bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares e que fermentam a lactose com produção de aldeído, ácido e gás a 35ºC em horas. O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas. O principal componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam essa capacidade.

3 Definição

4 Coliformes- significado em alimentos Totais: Utilizado para avaliar as condições higiênicas, sendo que altas contagens significam contaminação pós- processamento, limpezas e sanificações deficientes, tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o processamento ou estocagem. Termotolerantes: empregado como indicador de contaminação fecal, ou seja, de condições higiênico- sanitárias, visto presumir-se que a população deste grupo é constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro animais. Além de indicar possibilidade de presença de outros patógenos entéricos.

5 Técnicas Técnicas » Plaqueamento (sólido): aplica-se a amostras de matérias- primas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado 100 UFC/g ou mL. » NMP (líquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matérias- primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL. » NMP (líquido) em água e gelo: Aplica-se a amostras de água e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O valor é obtido em NMP/100mL.

6 Pesquisa de coliformes: método em placas. Amostra: açúcar cristal, morango, coxinha e hambúrguer

7 Ágar cristal violeta (VRBA) sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+; Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentação da lactose. Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+. Sais biliares – inibem Gram+; Mistura de fosfatos– impedem a acidificação do meio. Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. Com a fermentação da lactose e produção de ácido, ocorre precipitação desses corantes que fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli. Caldo verde brilhante bile 2% lactose Caldo EC Ágar eosina azul de metileno (EMB)

8 45C°/24 a 48h Plaqueamento sobrecamada Prova confirmativa para coliformes totais Prova presuntiva para coliformes totais Prova confirmativa para coliformes termotolerantes Em posição invertida Cada colônia para um caldo verde brilhante Para cada tubo positivo no caldo verde brilhante passar para um tubo de caldo EC Selecionar 3 colônias típicas e 3 atípicas para investigar 15 mL

9 Caracterização da E. coli De cada tubo EC positivo

10 Técnica de esgotamento – por estrias

11 Expressão dos resultados R =(C x c x d)/r R = Resultado C = número de colônias contadas c = número de colônias confirmadas r = número de colônias repicadas d = diluição utilizada Resultado final= R t (colônias típicas) + R a (colônias atípicas)

12 Exemplo de resultado final Diluição = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas. Para confirmação, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: R T = 20 x 4 x 100/5 = Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: R A = 10 x 2 x 100/5 = 400 O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas: Resultado final = R T + R A = = 2000 = 2,0 x 10 3 UFC/g ou mL.

13 Exemplo de resultado final Diluição = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas. Para confirmação, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: R T = ? Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: R A = ? O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas: Resultado final = R T + R A = ????????????? UFC/g ou mL.

14 Exercício 1. Na placa de VRBA e diluição = 20 colônias contadas, das quais 15 eram típicas e 5 atípicas; Para confirmação, foram repicadas 3 colônias de cada tipo para tubos verde brilhante e depois para tubos EC; 2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a confirmação de coliformes totais; 3. Para confirmação de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos repicados de colônias típicas, 2 positivos; e das 3 atípicas repicadas, 1 positiva. 4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de típicas quanto atípicas), 1 placa EMB típico deu positivo e 1 atípico positivo. Diante destes resultados, pergunta-se: 1. Qual o valor para coliformes a 35°C? 2. Qual o valor para coliformes a 45°C? 3. Qual o valor de E. coli/mL?

15 Pesquisa de coliformes: Número mais provável (NMP) Amostra: leite em pó, leite pasteurizado, água, açúcar refinado

16 NMP Técnica do número mais provável ou técnica dos tubos múltiplos- estimativa da quantidade de Mo presentes na amostra; Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três, cinco ou dez tubos; Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes)

17 NMP a) Teste presuntivo para coliformes totais– visa detectar a presença de microrganismos fermentadores de lactose. Meio utilizado: lauril sulfato triptose. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham. b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo verde brilhante lactose Bile 2%. Princípio: turvamento e produção de gás por bactérias gram negativas, características do grupo coliforme. c)Teste confirmativo para coliformes termotolerantes- utilização do meio de cultura seletivo Caldo EC e incubação em 44-45ºC. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham. c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas bioquímicas.

18 Poder tamponante Inibe Gram+ Inibem Gram+

19 Inibe Gram+

20 NMP – série 3 tubos Para cada EC+, um EMB 2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN

21 NMP – série 3 tubos (leite) Para cada EC+, um EMB 2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN De cada tubo AN

22 Exemplo Tubos positivos 3 1

23 Em todos os tubos e placas de TODAS as etapas, identificar o número da equipe, o nome da amostra e o mais importante a DILUIÇÃO que está ou a DILUIÇÃO precedente !!!!!

24 Combinação tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL, com 95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou mL

25 A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL. OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para séries de 3 tubos, com inóculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou mL, e respectivos intervalos de confiança 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na análise.

26 NMP- água e gelo Quando o limite de aceitação for <2,0/100mL, usar série de 5 tubos. Quando o limite de aceitação for <1,0/100mL, usar série de 10 tubos.

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31 Caracterização da E. coli De cada tubo EC positivo

32 Técnica de esgotamento – por estrias

33 Padrões microbiólógicos ProdutoTolerância para amostra indicativa – Coliformes Totais ou a 35 °C Tolerância para amostra indicativa – Coliformes Termotolerante s ou a 45 °C LegislaçãoTécnica a ser utilizada Água para consumo humano Ausência em 100mL Portaria 518, 2004 NMP – série de 10 tubos Leite pasteurizado C 4NMP/mL2NMP/mLIN 51, 2002NMP – série de 3 tubos- amostra pura Leite em pó-10NMP/gRDC 12, 2001NMP – série 3 tubos- amostra diluída Açúcar cristal-10 2 UFC/gRDC 12, 2001Plaqueamento

34 Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004

35 1. Prova do Indol; 2. Vermelho de metila-VM; 3. Voges-Proskauer-VP; 4. Citrato. Testes bioquímicos para coliformes- identificação da E. coli

36 1. Prova do Indol Triptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico + amônia desaminação + p-dimetilaminobenzaldeído +HCl + álcool (reativo de Kovacs) Composto quinoidal (vermelho) CH 2 do anel pirrólico da molécula do indol + o aldeído em meio ácido= quinona

37 2. Vermelho de metila-VM ácido láctico ácido acético Glicose fermentação ácido fórmico ácido mista ácido succínico ácido etílico INDICADOR: Vermelho de metila – escala de 4,4 a 6,0. pH 4,4 cor vermelha - prova positiva pH 6,0 cor amarela (acetoína) - prova negativa

38 3. Voges-Proskauer-VP Glicose 2 ác. pirúvico descarboxilação Acetilmetilcarbinol + -naftol +KOH 40% Diacetila (acetoína) Diacetila + núcleo guanidina do -naftol condensação Composto Vermelho OBS.: cor cobre é resultado negativo Agente oxidante Catalisador Fermentação butilenoglicol

39 4. Citrato ciclo de Krebs Citrato citratase ciclo da fermentação do citrato Citrato piruvato + CO 2 CO 2 + sódio carbonato de sódio Amônia como fonte de N pH alto Indicador de pH: azul de bromotimol pH 8,4=coloração azul-da-prússia pH 6,9= coloração verde pH 6,0= coloração amarela ;

40 Próxima semana: prova prática de bolores e leveduras 1. Imprimir roteiro de prova; 2. Estudar o roteiro, dúvidas tirar no horário de PA; 3. Cuidar com técnica e diluição. 4. Trazer os materiais abaixo para prova: Equipe 1Equipe 2Equipe 3Equipe 4 AMOSTRAS Queijo ralado Geléia (a granel de preferência) Papinha infantil de fruta Doce de abobóra a granel Legislação Port. 357/97 RDC 12, 2001 Padrão microbiológico ????


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