IPOG - Instituto de Pós-Graduação

Apresentação em tema: "IPOG - Instituto de Pós-Graduação"— Transcrição da apresentação:

1 IPOG - Instituto de Pós-Graduação
MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Contagem de Microrganismos Viáveis & Método Geral de Identificação de Patógenos Daiane Bridi Leonardo Chaiben Neura Stella Renata Maggi

2 IPOG - Instituto de Pós-Graduação
MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM PRODUTOS QUE NÃO NECESSITAM CUMPRIR O TESTE DE ESTERILIDADE Fonte:

3 Contagem de Microrganismos Viáveis Totais
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Contagem de Microrganismos Viáveis Totais Determina o n° de bactérias e fungos em produtos e MP não estéreis; Contagem por crescimento visível: 4 dias – Ágar Caseína-soja(30 -35°) 7 dias – Ágar Sabouraud-dextrose(20 -25°) Determinação: Método Filtração por Membrana Contagem por Placas Tubos Múltiplos Fonte: www. hotfrog.com.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

4 Teste: Amostragem: Técnicas Assépticas; Amostras: Três – início
unb.br IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Amostragem: Técnicas Assépticas; Amostras: Três – início Quatro – meio Três – Final Teste: Diluição O teste é realizado com a mistura das amostras. Diluição das amostras (dentro dos limites) UFC dentro dos limites do método a ser usado. Fonte: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

5 Método de Filtração Por Membrana
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Filtração Por Membrana Tipos de Membrana Nitrato de Celulose Acetato de Celulose Cuidados Especiais: Proteger do contato direto da luz ultravioleta; Proteger contra aerossóis; Evitar contaminação; Utilizar capela de fluxo laminar; Executar ensaios de contagem de partículas, velocidade e direção do ar; Porosidade máx. 0,45 µm Fonte: Materiais Esterilizados por Autoclavagem Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

6 Método IPOG - Instituto de Pós-Graduação
MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método Amostra de 10 mL ou diluição que represente 1g Membrana De Nitrato de Celulose Filtrar imediatamente Fonte: www. pt.vwr.com Fonte: www. pt.vwr.com Lavar as Membranas 3 vezes (100 mL de Líquido Estéril) 1º Membrana Placa de Petry com Meio I Ágar Caseína-Soja 2º Membrana Placa de Petry com Meio II Ágar Sabouraud-Dextrose Incubar 4 dias (30-35°C) Incubar 7 dias (20-25°C) Calcular o n° de Microrganismos por mL ou g de amostra Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

7 Preparação das Amostras:
IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Preparação das Amostras: Substâncias Solúveis em Água 10 g ou mL de mistura de amostras + 90 mL de Tampão Fosfato(pH 7,2) 6,5 – 7,5 HCL e NaOH 0,1 M Fluido I: 1 g de digesto peptido de tecido animal mL H2O (pH 7,1 ± 0,2) Agitar / Ajustar pH 2 x 10 mL Completar 100 mL + 90 mL de Fluido I + 90 mL de Fluido I Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido I Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Fonte: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

8 Preparação das Amostras:
IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Preparação das Amostras: Substâncias Oleosas Miscíveis em Água: 10 g ou mL de mistura de amostras + 90 mL de Fluido II a 45 – 48°C Fluido II: 1 g de digesto peptido de tecido animal + 1 mL de Polissorbato mL H2O (pH 7,1 ± 0,2) 6,5 – 7,5 HCL e NaOH 0,1 M Agitar / Ajustar pH 2 x 10 mL Completar 100 mL + 90 mL de Fluido II + 90 mL de Fluido II Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido II Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

9 Preparação das Amostras:
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Preparação das Amostras: Substâncias Solúveis em Miristato de Isopropila: 6 amostras de 1g ou 1ml de mistura de amostras Completar 100 mL com miristato de isopropila (45 – 48°C) Filtrar cada solução com membrana filtrante (para cada uma) Agitar Lavar as membranas com caldo nutriente esterilizado por filtração e aquecido a 45-48°C 3 membranas em Placa de Petry com Meio I Obs: para produtos de uso tópico – teste adicional – 1 membrana para placa com ágar para fermentação de anaeróbicos, incubando em jarra para anaeróbicos a °C por 3 dias. 3 membranas em Placa de Petry com Meio II Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

10 Método de Contagem em Placa
IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Bactérias Ou Placas de Petry 100 x ml de mistura de amostras ml de meio I liquefeito a 45°C Dispensar a mistura e amostras na superfície do meio solidificado na placa 2 placas para cada diluição Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não ultrapasse 300 por placa. Incubar a °C por 4 dias Contar o n° de colônias e calcular o resultado. Fonte: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

11 Método de Contagem em Placa
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Fungos Ou Placas de Petry 100 x ml de mistura de amostras ml de meio II liquefeito a 45°C Dispensar a mistura e amostras na superfície do meio solidificado na placa 2 placas para cada diluição Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não ultrapasse 100 por placa. Incubar a °C por 7 dias Contar o n° de colônias e calcular o resultado. Fonte: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

12 Método de Contagem em Placa
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Empregar no método de contagem de placas: 1 mL de preparação de amostra contendo 10 g ou 10 mL, diluídas ou dissolvidas em 100 mL de diluente. Cremes e Pomadas solúveis em Miristato de Isopropila: 10 g de mistura de amostras + 90 mL de caldo nutriente com 0,1% de tetradecilsulfato sódico a 45-48°C 4 alíquotas de 5 mL Placas de Petry x 150 mm Agitar até homogeneizar 2 Placas mL Meio I 2 Placas mL Meio II 45°C Teste Adicional: 2 x 1 mL da 1º diluição em placas 10 x 100 mm com mL de Ágar p/ Fermentação de Anaeróbicos. Incubar me jarra p/ anaeróbicos 30-35°C por 3 dias. Esperar solidificar, incubar, contar as colônias e os microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

13 Método de Contagem em Placa
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Cápsulas Vazias: 90 mL de tampão fosfato(pH 7,2) a 45-48°C sobre 50 cápsulas 1 mL da suspensão em 9 mL de Água (5:100) Agitar até suspensão total e completar a 100 mL(5:10) Se necessário, 1mL p/ 9 mL de água (5:1000) 1 mL de cada diluição em 4 placas 20x 100 mm 2 placas mL Meio I 2 placas mL Meio II ( liquefeito a 45° C) Solidificar Incubar Contar as colônias e Calcular o n° de microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte:

14 Método de Contagem em Placa
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Gelatinas: 10 g de mistura de amostras + 90 mL de água estéril a 48°C (1:10) Repouso por 1 h Banho-maria a 45°C por 30 min Agitação vigorosa intercalada Se necessário, 1 mL (1:100) em 9 mL – (1:1000) 1 mL em 9 mL de água estéril (1:100) Procedimento = cápsulas vazias Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte:

15 Método de Contagem em Placa
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Demais Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água: 10 g ou 10 mL da mistura de amostras mL de tampão fosfato(pH 7,2) (1:10) 1 mL + 9 mL água(1:100) Se necessário : 1mL em 9 mL de água (1:1000) Proceder conforme método de cápsulas vazias Dissolver e ajustar o pH 6,5-7,5 com Hcl ou NaOH 0,1 M Aerossóis: 10 g ou 10 mL + 90 mL de tampão fosfato (7,2) (1:10) 1 mL + 9 mL água(1:100) Resfriar 10 recipientes em álcool e gelo seco por 1h Completar 100 mL Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

16 Método de Contagem em Placa
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Contagem de Colônias: Contador de Colônias Apropriado iluminação artificial controlada; Lupa; contador registrador. Fonte: Considera-se para registros de resultados as placas que apresentam até: 300 colônias de bactérias: 100 colônias de fungos. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte:

17 Método de Contagem em Placa
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Contagem de Colônias: Calcula-se a média aritmética de cada diluição em relação as placas; Calcula-se o n° de microrganismos por g ou mL para cada diluição; Resultados expressos em Unidades Formadoras de Colônias ( UFC) Exemplo: Fonte: Média: (2,93 + 1,0 + 4,1 + 1,2) x Média : 2,3 x 104 Diluição Colônias p/ placa UFC / g ou mL 1: 100 293 2,93 x 104 100 1,00 x 104 1: 1000 41 4,1 x 104 12 1,2 x 104 Resultados: N° de colônias nas placas < 20 = menor diluição em UFC/ g ou mL. Placas não apresentam colônias = < que diluição menor (< 10 UFC / g ou mL. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

18 Método dos Tubos Múltiplos
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método dos Tubos Múltiplos Método utilizado quando se espera que o produto apresente densidade bacteriana baixa. Preparação diferenciada para amostras sólidas e amostras líquidas. Preparação das Amostras: Diluição 1:10 Amostras Líquidas Amostras Sólidas 10 g de amostra + 90 mL de diluente 1 mL de amostra + 9 mL de caldo de caseina-soja Para volumes maiores 25 g mL de diluente Pode ser adicionado de emulsificantes e neutralizantes Partindo-se da diluição 1:10, preparar 1:100 / 1:1000 a partir de Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

19 Método dos Tubos Múltiplos
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método dos Tubos Múltiplos Preparação das Amostras: 12 Tubos com 10 mL de caldo caseína-soja Tubos 1 / 2 / 3 Tubos 4 / 5 / 6 Tubos 7 / 8 / 9 Tubos 10 / 11 / 12 1 mL de diluente 1 mL de amostra (1:10) 1 mL de amostra (1:100) 1 mL de amostra (1:1000) Sem crescimento microbiano Incubar a 30-35°C 4 dias Tubos com crescimento = Positivos; Amostras que turvam o meio : confirmação de crescimento; Alçada de cada tubo p/ novo tubo caldo caseína-soja/semear em meio sólido Incubar novamente Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

20 IPOG - Instituto de Pós-Graduação
MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Meios e Diluentes Utilizados em Contagem de Microrganismos Segundo a Farmacopéia Brasileira Ágar Caseína-Soja (Meio I); Ágar Sabouraud-Dextrose (Meio II); Ágar para Fermentação de Anaeróbicos; Caldo Caseína-Soja; Caldo Nutriente; Fluido I; Fluido II; Tampão Fosfato pH 7,2; Tampão Cloreto de Sódio-Peptonado pH 7,0. Fonte: Fonte: Fonte: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

21 Nasal ou Respiratória:
- Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA MÉTODO GERAL PARA PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE PATÓGENOS Salmonella Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus; Produtos Farmacêuticos não estéreis Detecção de células viáveis de: MP de uso direto em fabricação Intramamária: Staphylococcus sp Streptococcus sp, grupo B Bacillus cereus Serratia marcescens Corynebacterium pyogenes Klebsiella sp Mycoplasma sp Enterobacter sp Pseudomonas sp Citrobacter sp Nocardia sp Proteus sp Cryptococcus neoformans Candida sp Patógenos devem ser Ausentes Nasal ou Respiratória: Enterobacter sp Serratia marcescens Klebsiella sp Candida albicans Proteus sp Acinetobacter sp Pseudomonas cepacia Pseudomonas maltophilia Pseudomonas stutzeri Tópica: Serratia marcescens Klebsiella sp Pseudomonas cepacia Pseudomonas maltophilia Pseudomonas stutzeri Streptococcus sp, grupo B Via Oral: Bacillus cereus Enterobacter sp Candida albicans Aspergillus flavus e parasiticus Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

22 Enriquecimento Não-seletivo
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Enriquecimento Não-seletivo Subst. Oleosas Miscíveis em Água Subst. Solúveis em Miristato de Isoproprila Subst. Solúveis em Água 10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Tampão fosfato 7,2 10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Fluido II a 45-48°C 6 porções de 1 g ou 1 mL mL de Miristato de Isoproprila a 45-48°C Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de Fluido I Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de Fluido II Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de caldo nutriente a 45-48°C Membrana em 300mL de caldo de enriquecimento Membrana em 300 mL de caldo de enriquecimento Fonte: Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

23 Enriquecimento Não-seletivo
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Enriquecimento Não-seletivo Pomadas e Cremes Insolúveis em Miristato de Isoproprila Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água Gelatinas 10 g de amostra mL de caldo de enriquecimento 10 g ou 10 mLde amostra mL de caldo de enriquecimento 2 porções de 5 g ou 5 mL mL de caldo de enriquecimento com 0,1% de polissorbato 80 Deixar a 48 °C por 1 h Se necessário ajustar o pH a 6,5-7,5 com HCl ou NaOH 0,1 M Se necessário ajustar pH 6,5-7,5 com HCl ou Na OH Banho-maria a 45°C 30 min Agitando em intervalos Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Na ausência de um Sistema de Filtração em Membrana, pode se proceder como “ Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água” Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

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25 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Pseudomonas aeruginosa Ágar cetrimida + material enriquecido em meio não seletivo Método de Estrias em Superfície Confirmação Citocromo oxidase: 1 gt de cloridrato de N,N-dimetil-p-fenilenodiamina . Rósea para marrom, vermelho escuro e negro em 10 a 30 min. Produção de Fluorescência: em ágar inclinado para deteccção de fluoresceína. Incubar a 30-37°C por 24 h. Fluorescência do ágar em luz UV a nm. 99% das cepas apresentam fluorescência. Crescimento a 41°C: em ágar inclinado de infusão cérebro e coração. Incubar em banho-maria ou estufa por 48 h. 99% crescem a 41°C. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

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27 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Staphylococcus aureus Confirmação Material enriquecido em meio não seletivo + ágar sal manitol-vermelho de fenol ou ágar de vogel johnson Coloração de Gram: cocos gram positivos; formato de cacho de uva. Coagulase: reconstituição liofilizada com plasma de coelho ou cavalo em água estéril; controle positivo e negativo em paralelo; tubo incubados em banho a 30-37°C(verificar formação de gel); verificar tubos em 2 / 4 / 24h; formação de gel em 24h: teste positivo Método de Estrias em Superfície Desoxirribose: ágar para teste de desoxirribose com verde de metila; repicar-se a colônia no meio; Incuba-se a 30-37°C por 24-48h; Fazer controle positivo; formação de zona incolor ao redor do crescimento: desoxirribose nuclease positiva; Deve ser positivo. Incubar a 36°C por 48h Ágar sal manitol: colônias amareladas, lisas, circundada por zona diferente(amarelo forte); Ágar vogle johnson: colônias negro brilhante circundade por zona amarela. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

28 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Salmonela Confirmação Repicar a colônia do meio não- seletivo p/ placa de ágar-verde brilhante Ágar Tríplice açúcar-ferro: Inocular a colônia; Fura-se a base não inclinada com fio reto retirando e passando na superfície inclinada; incuba-se a 30-37°C por 24h; Colônias apresentam: reação alcalina( cor vermelha), parte superior inclinada e ácida na base( cor amarelada) Se as reações forem positivas, prosseguir com demais testes. Inocular colônia em 100 mL de caldo de digestivo pancreático de caseína Incubar a 30-37°C por 24-48h Adicionar 0,5 mL do reagente Kovac e agitar suavemente Lisina-descarboxilase: Inocular em ágar lisina-ferro; Incubar a 30-37°C por 24h; Colônias apresentam: cor purpurea. Reação positiva de cor vermelha intensa. A salmonella sp. indol negativa. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

29 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Salmonela Confirmação Crescimento Citrato de Carbono: Repica-se a cultura em ágar citrato de simmons inclinado; Incuba-se a 30-37°C por 4 dias; Colônias apresentam: cor da parte inclinada azul. Fonte: Urease: Repica-se a cultura em ágar uréia inclinado; Incuba-se a 30-37°C por 4 dias; Colônias : típicas não produzem urease. Fermentação da Lactose: Repica-se a cultura em caldo lactose; Incuba-se a 30-37°C por 24h; Colônias: maioria das cepas não fermenta lactose, permanecendo o meio inalterado Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

30 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Transferir colônias vermelho tijolo para nova placa com ágar mac conkey Se houver crescimento heterogêneo Repicar meio não-seletivo em ágar mac conkey Incubar a colônia em ágar peptona-ferro Confirmação Ágar de eosina-cloreto de metiltionímio: Colônia incubada em ágar mac conkey para placa contendo ágar de eosina cloreto de metiltionímio; Incuba-se a 30-37°C por 24h; Colônias Podem evidenciar escherichia coli quando apresentarem cor preta, esverdeadas e brilhantes. Inocular furando a base não inclinado com fio reto / retirar e passar pela superfície inclinada Incubar a 30-37°C por 24h Escherichia coli não produz gás H2S Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

31 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação Ágar Tríplice açúcar-ferro: Colônia em ágar de eosina cloreto de metiltionímio inoculada em ágar tríplice açúcar-ferro; Segue-se procedimento como a salmonella; Colônias apresentam: Reação alcalina(cor vermelha) e ácida(amarela) na parte superior (inclinada) ; Ácida (amarela) na base; Pode formar gás H2S. Fonte: Teste de Indol: Inocular tubo contendo caldo de digesto pancreático de caseína com colônia em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; Incubar a 30-37°C por 48h; Adicinar 0,5 mL de reagente kovac; Colônias apresentam: cor vermelha intensa(presença de indol) Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

32 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação Teste de vermelho de Metila: Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; Incubar a 30-37°C por 18-48h; Adicionar 5-6 gts de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura; Colônias apresentam: Cor vermelho brilhante – reações positivas fortemente ácidas; Vermelha-alaranjadas – reações fracamente positivas; Amarela – reações negativas Escherichia coli é vermelho de metila positivo. Fonte: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

33 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação Teste de Voges-Proskauer: Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; Incubar a 30-37°C por 24h; Adicionar 4 mL de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura; Incubar a 35-37°C por 1h; Colônias apresentam: Cor vermelha – presença de diacetila; Escherichia coli é voges-proskauer negativa. Fonte: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

34 Fase Seletiva e Testes de Confirmação
IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação Crescimento a partir de Citrato de Carbono como única fonte de carbono: Colônia em ágar eosina-cloreto de metiltionímio inoculada em ágar citrato de simmons inclinado; Incubar a 30-37°C por 4 dias; Escherichia coli não utiliza citrato como fonte única de carbono, não ocorrendo crescimento Esterilização e Acondicionamento dos Meios de Cultura Meios em Tubos Meios de Cultura Incubar a 30-35°C por 24h Conservar sob refrigeração Placas estéreis de 100 x 20 mm Tubos 18 x 150 mm 10 mL Esterilizar a 121°C por 15 min. 25 x 200 mm 15-20 mL Dissolver os ingredientes Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988