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Contagem de Microrganismos Viáveis & Método Geral de Identificação de Patógenos IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica.

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1 Contagem de Microrganismos Viáveis & Método Geral de Identificação de Patógenos IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Daiane Bridi Leonardo Chaiben Neura Stella Renata Maggi

2 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM PRODUTOS QUE NÃO NECESSITAM CUMPRIR O TESTE DE ESTERILIDADE IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fonte:

3 Contagem de Microrganismos Viáveis Totais Determina o n° de bactérias e fungos em produtos e MP não estéreis; Contagem por crescimento visível: 4 dias – Ágar Caseína-soja(30 -35°) 7 dias – Ágar Sabouraud-dextrose(20 -25°) Determinação: IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método Filtração por Membrana Contagem por Placas Tubos Múltiplos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. hotfrog.com.br

4 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Amostragem: Técnicas Assépticas; Amostras: Três – início Quatro – meio Três – Final Teste: Diluição O teste é realizado com a mistura das amostras. Diluição das amostras (dentro dos limites) UFC dentro dos limites do método a ser usado. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 unb.br Fonte: www. unb.br

5 Tipos de Membrana » Nitrato de Celulose » Acetato de Celulose Cuidados Especiais: » Proteger do contato direto da luz ultravioleta; » Proteger contra aerossóis; » Evitar contaminação; » Utilizar capela de fluxo laminar; » Executar ensaios de contagem de partículas, velocidade e direção do ar; IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Filtração Por Membrana Porosidade máx. 0,45 µm Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. typesolution.pt

6 Método IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Amostra de 10 mL ou diluição que represente 1g Filtrar imediatamente Membrana De Nitrato de Celulose Lavar as Membranas 3 vezes (100 mL de Líquido Estéril) 1º Membrana Placa de Petry com Meio I Ágar Caseína-Soja 2º Membrana Placa de Petry com Meio II Ágar Sabouraud-Dextrose Incubar 4 dias (30-35°C)Incubar 7 dias (20-25°C) Calcular o n° de Microrganismos por mL ou g de amostra Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. pt.vwr.com

7 Preparação das Amostras: Substâncias Solúveis em Água IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido I Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos 10 g ou mL de mistura de amostras + 90 mL de Tampão Fosfato(pH 7,2) Agitar / Ajustar pH 6,5 – 7,5 HCL e NaOH 0,1 M 2 x 10 mL Completar 100 mL + 90 mL de Fluido I + 90 mL de Fluido I Fluido I: 1 g de digesto peptido de tecido animal mL H2O (pH 7,1 ± 0,2) Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. cial-paulinia.com.br

8 IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Substâncias Oleosas Miscíveis em Água: 10 g ou mL de mistura de amostras + 90 mL de Fluido II a 45 – 48°C Agitar / Ajustar pH 6,5 – 7,5 HCL e NaOH 0,1 M Completar 100 mL 2 x 10 mL + 90 mL de Fluido II + 90 mL de Fluido II Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido II Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Fluido II: 1 g de digesto peptido de tecido animal + 1 mL de Polissorbato mL H2O (pH 7,1 ± 0,2) Preparação das Amostras: Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

9 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Substâncias Solúveis em Miristato de Isopropila: 6 amostras de 1g ou 1ml de mistura de amostras Agitar Completar 100 mL com miristato de isopropila (45 – 48°C) 3 membranas em Placa de Petry com Meio I Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Obs: para produtos de uso tópico – teste adicional – 1 membrana para placa com ágar para fermentação de anaeróbicos, incubando em jarra para anaeróbicos a 30-35°C por 3 dias. Filtrar cada solução com membrana filtrante (para cada uma) Lavar as membranas com caldo nutriente esterilizado por filtração e aquecido a 45-48°C 3 membranas em Placa de Petry com Meio II Preparação das Amostras : Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

10 IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Bactérias Dispensar a mistura e amostras na superfície do meio solidificado na placa Placas de Petry 100 x ml de mistura de amostras ml de meio I liquefeito a 45°C Ou Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não ultrapasse 300 por placa. 2 placas para cada diluição Incubar a °C por 4 dias Contar o n° de colônias e calcular o resultado. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. cial-paulinia.com.br

11 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Fungos Dispensar a mistura e amostras na superfície do meio solidificado na placa Placas de Petry 100 x ml de mistura de amostras ml de meio II liquefeito a 45°C Ou Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não ultrapasse 100 por placa. 2 placas para cada diluição Incubar a °C por 7 dias Contar o n° de colônias e calcular o resultado. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte:

12 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras : Empregar no método de contagem de placas: 1 mL de preparação de amostra contendo 10 g ou 10 mL, diluídas ou dissolvidas em 100 mL de diluente. Cremes e Pomadas solúveis em Miristato de Isopropila: 10 g de mistura de amostras + 90 mL de caldo nutriente com 0,1% de tetradecilsulfato sódico a 45-48°C Agitar até homogeneizar 4 alíquotas de 5 mL 4 Placas de Petry 20 x 150 mm 2 Placas mL Meio I 2 Placas mL Meio II 45°C Esperar solidificar, incubar, contar as colônias e os microrganismos Teste Adicional: 2 x 1 mL da 1º diluição em placas 10 x 100 mm com mL de Ágar p/ Fermentação de Anaeróbicos. Incubar me jarra p/ anaeróbicos 30-35°C por 3 dias. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

13 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Cápsulas Vazias: 90 mL de tampão fosfato(pH 7,2) a 45-48°C sobre 50 cápsulas Agitar até suspensão total e completar a 100 mL(5:10) 1 mL da suspensão em 9 mL de Água (5:100) Se necessário, 1mL p/ 9 mL de água (5:1000 ) 1 mL de cada diluição em 4 placas 20x 100 mm 2 placas mL Meio I 2 placas mL Meio II ( liquefeito a 45° C) Solidificar Incubar Contar as colônias e Calcular o n° de microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. millipore.com

14 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras : Gelatinas: 10 g de mistura de amostras + 90 mL de água estéril a 48°C (1:10) Repouso por 1 h Banho-maria a 45°C por 30 min Agitação vigorosa intercalada 1 mL em 9 mL de água estéril (1:100) Se necessário, 1 mL (1:100) em 9 mL – (1:1000) Procedimento = cápsulas vazias Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. millipore.com

15 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Demais Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água: 10 g ou 10 mL da mistura de amostras + 90 mL de tampão fosfato(pH 7,2) (1:10) Dissolver e ajustar o pH 6,5-7,5 com Hcl ou NaOH 0,1 M 1 mL + 9 mL água(1:100) Se necessário : 1mL em 9 mL de água (1:1000 ) Proceder conforme método de cápsulas vazias Aerossóis: Resfriar 10 recipientes em álcool e gelo seco por 1h 10 g ou 10 mL + 90 mL de tampão fosfato (7,2) (1:10 ) Completar 100 mL 1 mL + 9 mL água(1:100) Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

16 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: Contagem de Colônias : Contador de Colônias Apropriado iluminação artificial controlada; Lupa; contador registrador. Considera-se para registros de resultados as placas que apresentam até: 300 colônias de bactérias: 100 colônias de fungos. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. cial-paulinia.com.br

17 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Contagem de Colônias: Calcula-se a média aritmética de cada diluição em relação as placas; Calcula-se o n° de microrganismos por g ou mL para cada diluição; Resultados expressos em Unidades Formadoras de Colônias ( UFC) Exemplo: DiluiçãoColônias p/ placaUFC / g ou mL 1: ,93 x : ,00 x : ,1 x : ,2 x 10 4 Média: (2,93 + 1,0 + 4,1 + 1,2) x Média : 2,3 x 10 4 Resultados: N° de colônias nas placas < 20 = menor diluição em UFC/ g ou mL. Placas não apresentam colônias = < que diluição menor (< 10 UFC / g ou mL. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. unb.br

18 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método dos Tubos Múltiplos Método utilizado quando se espera que o produto apresente densidade bacteriana baixa. Preparação diferenciada para amostras sólidas e amostras líquidas. Preparação das Amostras: Diluição 1:10 Amostras Sólidas Amostras Líquidas 10 g de amostra + 90 mL de diluente 1 mL de amostra + 9 mL de caldo de caseina-soja Pode ser adicionado de emulsificantes e neutralizantes Para volumes maiores 25 g mL de diluente Partindo-se da diluição 1:10, preparar 1:100 / 1:1000 a partir de Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

19 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método dos Tubos Múltiplos Preparação das Amostras: 12 Tubos com 10 mL de caldo caseína-soja Tubos 1 / 2 / 3 1 mL de amostra (1:10) Tubos 4 / 5 / 6 1 mL de amostra (1:100) 1 mL de amostra (1:1000) Tubos 7 / 8 / 9Tubos 10 / 11 / 12 Incubar a 30-35°C 4 dias 1 mL de diluente Sem crescimento microbiano Tubos com crescimento = Positivos; Amostras que turvam o meio : confirmação de crescimento; Alçada de cada tubo p/ novo tubo caldo caseína-soja/semear em meio sólido Incubar novamente Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

20 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Meios e Diluentes Utilizados em Contagem de Microrganismos Segundo a Farmacopéia Brasileira Ágar Caseína-Soja (Meio I); Ágar Sabouraud-Dextrose (Meio II); Ágar para Fermentação de Anaeróbicos; Caldo Caseína-Soja; Caldo Nutriente; Fluido I; Fluido II; Tampão Fosfato pH 7,2; Tampão Cloreto de Sódio-Peptonado pH 7,0. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. hotfrog.com.br Fonte: www. interlabdist.com.br Fonte: www. hotfrog.com.br

21 - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA MÉTODO GERAL PARA PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE PATÓGENOS Salmonella Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus; Detecção de células viáveis de: Produtos Farmacêuticos não estéreis MP de uso direto em fabricação Via Oral: Bacillus cereus Enterobacter sp Candida albicans Aspergillus flavus e parasiticus Tópica: Serratia marcescens Klebsiella sp Pseudomonas cepacia Pseudomonas maltophilia Pseudomonas stutzeri Streptococcus sp, grupo B Nasal ou Respiratória: Enterobacter sp Serratia marcescens Klebsiella sp Candida albicans Proteus sp Acinetobacter sp Pseudomonas cepacia Pseudomonas maltophilia Pseudomonas stutzeri Intramamária: Staphylococcus sp Streptococcus sp, grupo B Bacillus cereus Serratia marcescens Corynebacterium pyogenes Klebsiella sp Mycoplasma sp Enterobacter sp Pseudomonas sp Citrobacter sp Nocardia sp Proteus sp Cryptococcus neoformans Candida sp Patógenos devem ser Ausentes Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

22 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Enriquecimento Não-seletivo Subst. Solúveis em Água 10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Tampão fosfato 7,2 Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de Fluido I Membrana em 300mL de caldo de enriquecimento Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Subst. Oleosas Miscíveis em Água 10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Fluido II a 45-48°C Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de Fluido II Subst. Solúveis em Miristato de Isoproprila 6 porções de 1 g ou 1 mL mL de Miristato de Isoproprila a 45-48°C Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de caldo nutriente a 45-48°C Membrana em 300 mL de caldo de enriquecimento Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. millipore.com

23 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Enriquecimento Não-seletivo Pomadas e Cremes Insolúveis em Miristato de Isoproprila 2 porções de 5 g ou 5 mL mL de caldo de enriquecimento com 0,1% de polissorbato 80 Se necessário ajustar pH 6,5-7,5 com HCl ou Na OH Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Gelatinas 10 g de amostra mL de caldo de enriquecimento Deixar a 48 °C por 1 h Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Banho-maria a 45°C 30 min Agitando em intervalos Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água 10 g ou 10 mLde amostra mL de caldo de enriquecimento Se necessário ajustar o pH a 6,5-7,5 com HCl ou NaOH 0,1 M Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Na ausência de um Sistema de Filtração em Membrana, pode se proceder como Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

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25 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Pseudomonas aeruginosa Confirmação Citocromo oxidase: 1 gt de cloridrato de N,N-dimetil-p-fenilenodiamina. Rósea para marrom, vermelho escuro e negro em 10 a 30 min. Produção de Fluorescência: em ágar inclinado para deteccção de fluoresceína. Incubar a 30-37°C por 24 h. Fluorescência do ágar em luz UV a nm. 99% das cepas apresentam fluorescência. Crescimento a 41°C: em ágar inclinado de infusão cérebro e coração. Incubar em banho-maria ou estufa por 48 h. 99% crescem a 41°C. Ágar cetrimida + material enriquecido em meio não seletivo Método de Estrias em Superfície Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

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27 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Staphylococcus aureus Material enriquecido em meio não seletivo + ágar sal manitol-vermelho de fenol ou ágar de vogel johnson Método de Estrias em Superfície Incubar a 36°C por 48h Ágar sal manitol: colônias amareladas, lisas, circundada por zona diferente(amarelo forte); Ágar vogle johnson: colônias negro brilhante circundade por zona amarela. Confirmação Coloração de Gram: cocos gram positivos; formato de cacho de uva. Coagulase: reconstituição liofilizada com plasma de coelho ou cavalo em água estéril; controle positivo e negativo em paralelo; tubo incubados em banho a 30-37°C(verificar formação de gel); verificar tubos em 2 / 4 / 24h; formação de gel em 24h: teste positivo Desoxirribose: ágar para teste de desoxirribose com verde de metila; repicar-se a colônia no meio; Incuba-se a 30-37°C por 24-48h; Fazer controle positivo; formação de zona incolor ao redor do crescimento: desoxirribose nuclease positiva; Deve ser positivo. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

28 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Salmonela Fase Seletiva e Testes de Confirmação Repicar a colônia do meio não- seletivo p/ placa de ágar-verde brilhante Inocular colônia em 100 mL de caldo de digestivo pancreático de caseína Incubar a 30-37°C por 24-48h Adicionar 0,5 mL do reagente Kovac e agitar suavemente Reação positiva de cor vermelha intensa. A salmonella sp. indol negativa. Confirmação Ágar Tríplice açúcar-ferro: Inocular a colônia; Fura-se a base não inclinada com fio reto retirando e passando na superfície inclinada; incuba-se a 30-37°C por 24h; Colônias apresentam: reação alcalina( cor vermelha), parte superior inclinada e ácida na base( cor amarelada) Se as reações forem positivas, prosseguir com demais testes. Lisina-descarboxilase: Inocular em ágar lisina-ferro; Incubar a 30-37°C por 24h; Colônias apresentam: cor purpurea. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

29 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Confirmação Salmonela Fase Seletiva e Testes de Confirmação Crescimento Citrato de Carbono: Repica-se a cultura em ágar citrato de simmons inclinado; Incuba-se a 30-37°C por 4 dias; Colônias apresentam: cor da parte inclinada azul. Urease: Repica-se a cultura em ágar uréia inclinado; Incuba-se a 30-37°C por 4 dias; Colônias : típicas não produzem urease. Fermentação da Lactose: Repica-se a cultura em caldo lactose; Incuba-se a 30-37°C por 24h; Colônias: maioria das cepas não fermenta lactose, permanecendo o meio inalterado Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. cial-paulinia.com.br

30 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Repicar meio não-seletivo em ágar mac conkey Incubar a colônia em ágar peptona-ferro Inocular furando a base não inclinado com fio reto / retirar e passar pela superfície inclinada Incubar a 30-37°C por 24h Se houver crescimento heterogêneo Transferir colônias vermelho tijolo para nova placa com ágar mac conkey Confirmação Ágar de eosina-cloreto de metiltionímio: Colônia incubada em ágar mac conkey para placa contendo ágar de eosina cloreto de metiltionímio; Incuba-se a 30-37°C por 24h; Colônias Podem evidenciar escherichia coli quando apresentarem cor preta, esverdeadas e brilhantes. Escherichia coli não produz gás H2S Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

31 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação Ágar Tríplice açúcar-ferro: Colônia em ágar de eosina cloreto de metiltionímio inoculada em ágar tríplice açúcar-ferro; Segue-se procedimento como a salmonella; Colônias apresentam: Reação alcalina(cor vermelha) e ácida(amarela) na parte superior (inclinada) ; Ácida (amarela) na base; Pode formar gás H 2 S. Teste de Indol: Inocular tubo contendo caldo de digesto pancreático de caseína com colônia em ágar de eosina- cloreto de metiltionímio; Incubar a 30-37°C por 48h; Adicinar 0,5 mL de reagente kovac; Colônias apresentam: cor vermelha intensa(presença de indol) Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte:

32 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Confirmação Escherichia coli Teste de vermelho de Metila: Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; Incubar a 30-37°C por 18-48h; Adicionar 5-6 gts de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura; Colônias apresentam: Cor vermelho brilhante – reações positivas fortemente ácidas; Vermelha-alaranjadas – reações fracamente positivas; Amarela – reações negativas Escherichia coli é vermelho de metila positivo. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www. farturaalimentos.org.br

33 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Escherichia coli Confirmação Fase Seletiva e Testes de Confirmação Teste de Voges-Proskauer: Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; Incubar a 30-37°C por 24h; Adicionar 4 mL de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura; Incubar a 35-37°C por 1h; Colônias apresentam: Cor vermelha – presença de diacetila; Escherichia coli é voges-proskauer negativa. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte:

34 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Escherichia coli Fase Seletiva e Testes de Confirmação Confirmação Crescimento a partir de Citrato de Carbono como única fonte de carbono: Colônia em ágar eosina-cloreto de metiltionímio inoculada em ágar citrato de simmons inclinado; Incubar a 30-37°C por 4 dias; Escherichia coli não utiliza citrato como fonte única de carbono, não ocorrendo crescimento Esterilização e Acondicionamento dos Meios de Cultura Meios de Cultura Esterilizar a 121°C por 15 min. Placas estéreis de 100 x 20 mm Incubar a 30-35°C por 24h Conservar sob refrigeração Meios em Tubos Dissolver os ingredientes Tubos 18 x 150 mm 10 mL 25 x 200 mm mL Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA


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