A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a menor proliferação, aumento da apoptose.

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1 A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos? Controle: Stat3fl/fl TCD4+ naïve marcadas CFSE 5, 7, 9 e 14d Linfonodos Mesentéricos Baço FACS CFSE+ (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl Rag2-/- 98,11 86,4 39,2 81,7 STAT3 influencia, portanto, no potencial de proliferação de TCD4+. Já a ausência de Stat3 atrasa mas não impede a proliferação celular.

2 A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- de acumular em condições linfopênicas e homeostática pode ser devido a menor proliferação, aumento da apoptose ou ambos? Controle: Stat3fl/fl anti-CD3, anti-CD28 IL-6 ou IL-21 FACS Annexin-V/PI TCD4+ naïve (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl 72h STAT3 além de influenciar na proliferação de TCD4+, regula também a sobrevivência de células T.

3 anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ
STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação? Regulação gênica Controle: Stat3fl/fl anti-CD3, anti-CD28 IL-6, TGF-β, anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ IL-6 1h ChIP-Seq anti-pSTAT3 anti-H3K4Me TCD4+ Baço e linfonodos TCD4+ naïve CD4+CD44-CD62L+ (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl 72h

4 anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ
STAT3 regula então quais genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação? Expressão gênica Controle: Stat3fl/fl anti-CD3, anti-CD28 IL-6 e/ou TGF-β, anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ IL-6 1h TCD4+ Baço e linfonodos TCD4+ naïve CD4+CD44-CD62L+ Microarray PCR em Tempo Real (Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl 72h STAT3 é importante para na regulação de genes envolvidos no controle de sobrevivência e proliferação, mas não é o único fator.

5 Conclusões STAT3 é essencial para é essencial para a diferenciação de células Th17, in vivo, no modelo de colite e, na sua ausência as células T tendem a diferenciarem-se em Treg; Na diferenciação para Th17, STAT3 é tanto fator de transcrição, quanto regulador transcricional; STAT3 tem papel importante na proliferação de células TCD4+ durante respostas inflamatórias; Entretanto STAT3 é não essencial para expansão homeostática de células TCD4+, devendo, portanto, atuar em comunhão com outros fatores de transcrição.

6 Objetivo Determinar a participação de STAT3 no desenvolvimento de Th2, através da avaliação da produção de citocinas e expressão de fatores de transcrição.

7 STAT3 é ativado durante diferenciação de Th2?
Anti- Phospho-STAT3 e STAT6 Anti-CD3 e Anti-CD28 IL-4 anti-INF-γ + WT Stat3CD4-/- Citometria TCD4 naive

8 STAT3 é ativado durante diferenciação de Th2?
Anti- Phospho-STAT3 e STAT6 DO11.10 Anti-CD3 ou OVA + APC Céls. T TCR transgênicas Citometria STAT3 é fosforilado durante diferenciação de células Th2.

9 Quais citocinas participam da ativação de STAT3 durante diferenciação de Th2?
Acs Bloqueio Anti-CD3 e anti-CD28 + ELISA TCD4 naive 5 dias WT 4 dias FACs IL-2, IL-6 e IL-21 participam na ativação de STAT3 durante diferenciação de células Th2 (uma vez que o bloqueio das mesmas prejudica a expressão de citocinas Th2)

10 STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?
Anti-CD3 e Anti-CD28 IL-4 e anti-INF-γ + reestimuladas 1x106 céls 5 dias Anti-CD3/24h WT Stat3CD4-/- ELISA TCD4 naive

11 STAT3 é requerido na diferenciação de Th2?
Anti-CD3 RNA qPCR WT Stat3CD4-/- TCD4 naive STAT3 é importante na diferenciação de Th2

12 STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição?
Diferenciação céls Isolamento céls Diferentes dias Expressão gênica RNA WT Stat3CD4-/- TCD4 naive qPCR STAT3 é requerido para a expressão de fatores de transcrição.

13 STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (está envolvido nas modificações do DNA)?
WT Stat3CD4-/- TCD4 naive Diferenciação ou não de céls Imunoprecipitação Cromatina (ChIP) qPCR H3K4me3 H3K36me3 Ativação gênica Este resultado sugere que Stat3 tem um papel na prevenção destas modificações H3K17me3- Inibição gênica

14 STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (interage com o DNA)?
Anticorpo controle ChIP qPCR WT Anticorpos STAT3 TCD4 naive

15 STAT3 é requerido para expressão de fatores de transcrição (afeta acessibilidade com a cromatina)?
Diferenciação 5 dias Isola núcleo Digestão c nuclease 10 min* WT Stat3CD4-/- qPCR TCD4 naive Stat3 interage com o DNA e a acessibilidade com a cromatina é diminuída. * Nuclease cliva o DNA em pontos acessíveis que tem modificações ativas na transcrição.

16 c expressão de retrovírus
A transdução de alguns fatores de transcrição para o Stat3CD4-/- resulta na “recuperação”da produção de citocinas? Reestimulação Diferenciação 2 dias Trandução c CT, Batf ou Maf c expressão de retrovírus Anti-CD3 por 24h WT Stat3CD4-/- TCD4 naive ELISA Maf e Batf provavelmente representam alvos de STAT3 durante desenvolvimento de Th2, e os defeitos na produção de citocinas Th2 na ausência de STAT3 são resultados de efeitos downstream dos fatores de transcrição.

17 Mutantes para STAT ativo
2 aminoácidos com mutação no domínio SH2 que tornam constitutivamente ativados na ausência de estímulo. STAT6VT STAT3C STAT3C Transduzido em céls TCD4 naive Céls T cultivadas sob condições Th1 transduzidas com retrovírus expressando STAT6VT e STAT3C sozinhos ou em combinação

18 STAT3 ativado é capaz de restaurar a produção de citocinas de padrão Th2?
Mutantes para STAT constitutivamente ativos Reestimuladas Transdução Com C ou STAT3C TCD4 naive 5 dias 48h Anti-CD3/24h ELISA Ativadas

19 STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2?
Mutantes para STAT constitutivamente ativos Transdução com C, STAT6VT, STAT3C ou ambos Reestimuladas 48h sob condições Th1 5 dias TCD4 naive Anti-CD3/24h ELISA

20 STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2 in vivo?
TCD4 isoladas do baço de: Anti-CD3 por 24h WT STAT6VT STAT6VT Stat3Cd4-/- ELISA Estes resultados demonstraram que STAT3 e STAT6 cooperam na produção de citocinas de padrão Th2

21 STAT3 atua sobre os genes alvo de STAT6?
Anti-CD3 e anti-CD28 3 dias ChIP-anti-STAT6 Sob condições Th2 WT Stat3CD4-/- qPCR TCD4 naive

22 STAT6 foi capaz de induzir expressão de fatores de transcrição na ausência de STAT3?
TCD4 isoladas de: reestimuladas Anti-CD3 6 h RNA WT STAT6VT STAT6VT Stat3Cd4-/- qPCR Estes resultados sugerem que STAT3 facilita a habilidade de STAT6 ligar aos genes alvo e na indução da expressão de fatores de transcrição.

23 STAT3 é requerido in vivo para diferenciação de Th2 na inflamação alérgica?
Desafios intranasais Imunização Contagem OVA e Alum BAL 2 semanas após 2seg imunização WT Stat3CD4-/- FACs

24 Sobrenadante de cultura
STAT3 é requerido in vivo para diferenciação de Th2 na inflamação alérgica? BAL e Sobrenadante de cultura Esplenócitos OVA por 72h ELISA WT Stat3CD4-/-

25 STAT3 é requerido na inflamação alérgica in vivo?
Blefarite e dermatite alérgica WT STAT6VT STAT6VT Stat3Cd4-/- Eosinófilos do BAL

26 STAT3 é requerido na inflamação alérgica in vivo?
Pulmão Hematoxilina-eosina STAT6VT Stat3Cd4-/- WT STAT6VT Estes resultados demonstraram que a perda de STAT3 em células T protege o camundongo do desenvolvimento de doenças inflamatórias mediadas por Th2.

27 doenças inflamatórias
Conclusão STAT3 STAT6 Proteção contra doenças inflamatórias IL-2 STAT5 IL-4 Th2 STAT6 STAT3 IL-6/IL-21/IL-2