Cromatografia em Camada Delgada

Apresentação em tema: "Cromatografia em Camada Delgada"— Transcrição da apresentação:

1 Cromatografia em Camada Delgada
Discentes: Daniely de Godoy Silva Germano Blaquez Junior Gislaine Ap. da Cunha Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira Profª Amanda Coelho Danuello

2 Histórico da Cromatografia em Camada Delgada
BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos. Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a Cromatografia em Camada Delgada, para análise de produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os sólidos ao suporte. Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL. This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.

3 Cromatografia : Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.

4 Técnicas cromatográficas
Cromatografia planar: Fase estacionária permanece em um plano Cromatografia em coluna: Fase estacionária permanece num tubo

5 Cromatografia Planar Coluna Técnica Líquido Gás
Critério de classificação Cromatografia Planar Coluna Líquido Gás Fase ligada Sólido CP CCD CGL CGS CGFL CLL CLS CE CLFL CTI CB Técnica Fase Móvel Fase Estacionária Tipo de cromatografia

6 Outra Classificação Fase Normal Polaridade: FE > FM
FE utilizada : Sílica G > polaridade < polaridade Fase Reversa Polaridade: FE < FM FE utilizada: Sílica C18 < polaridade > polaridade

7 MECANISMO DE AÇÃO ABSORÇÃO ADSORÇÃO

8 Mecanismos - + Adsorção Partição Exclusão Troca Iônica
Líquido/gás gel/sólido Líquido/gás líquido Líquido/gás sólido Troca Iônica Líquido sólido + -

9 FORÇAS INTERMOLECULARES
MOLÉCULAS APOLARES Ex: Hidrocarbonetos FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON Afastadas = Não existe atração Molécula apolar Molécula apolar Aproximação = Indução Dipolo instantâneo Atração

10 Molécula polar sem H ligado a F, ou O ou N
Dipolo - Dipolo Molécula polar sem H ligado a F, ou O ou N Moléculas Polares Ligação de Hidrogênio H ligado a F, ou O, ou N

11 Cromatografia em Camada Delgada
Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.

12 Aplicações: Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um extrato orgânico; Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas; Estudos de reações : presença de intermediários estáveis; Análise da pureza de compostos; Análise da eficiência de: destilação e cristalização

13 Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada
Simplicidade; Baixo custo; Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o conteúdo de uma mancha ou de uma banda;

14 ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD
Processo de separação varia em função da quantidade de água presente no adsorvente: Ausência de água = Adsorção Presença de água = Partição Exemplos de adsorventes: Sílica-Gel ou àcido Silícico; Óxido de alumínio ou alumina; Celulose; Kieselgur; Poliamida; Kieselgur Alumina Sílica gel

15 Sílica gel ou Ácido silícico
Mais usada na CCD Substância porosa e amorfa. Apresenta caráter ácido. Possui característica polar, devido à presença de grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve apresentar número de hidroxilas razoável para ser seletivo na separação de substâncias de diferentes polaridades Mecanismo de adsorção: -Si-OH: Interações polares por ligação de hidrogênio, como doador ou aceptor de H. -Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo Tratamento térmico  eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 105 a 110ºC) Caracterização do tipo básico de sílica gel : G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante); H: indica ausência de aglutinante; F: indica adição de substâncias fluorescentes; P: indica adsorvente para uso preparativo; R: indica adsorvente de alto grau de pureza; Preparação: 30g de sílica com mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 mm CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica! This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.

16 Sílica C18 Usada em cromatografia de fase reversa, em que a fase estacionária é menos polar que a fase móvel

17 Alumina ou Óxido de Alumínio
Segundo adsorvente mais empregado em CCD; Há três grupos deste adsorvente: ÁCIDA pH 4,0 BÁSICA pH 9,0 NEUTRA pH 7,0 Mecanismo de adsorção: Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados) O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+ A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min. A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos. Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1. Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1. Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.

18 Kieselgur ou terra de diatomáceas
Celulose Existem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose microcristalina. Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas aplicadas na CCD: Mecanismo: Partição ou troca iônica. Kieselgur ou terra de diatomáceas É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis. Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução. Poliamida Separação de fenóis e ácidos carboxílicos A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito. Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas

19 Técnica Geral Escolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas; Ativação das placas cromatográficas; Seleção da fase móvel; Aplicação das amostras nas cromatoplacas; Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma; Revelação dos cromatogramas; Documentação; Calculo do fator de retenção Rf;

20 Escolha da fase estacionária
Liofilicidade e liofobicidade Interação com os componentes (polaridade) Necessidade de aditivos Aglutinantes Substâncias fluorescentes Capacidade adsorvedora

21 Preparação da placas As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes. Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.

22 Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.

23 Procedimentos para a preparação das placas
Limpeza da placa de vidro  detergente e água corrente (eliminação de gordura); Secagem  em estufa

24 Preparação das camadas finas dos adsorventes:
Utilização de espalhadores ( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.

25 Riscar as placas, determinando a altura de ínicio e fim da cromatografia

26 Ativação das placas Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro. Exemplo : Sílica e alumina  estufa 105 – 110 ºC por 30 – 60 min; Celulose  estufa 105ºC por 10 min;

27 Seleção da fase móvel Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel. Método de seleção Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto. Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: constitui um processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.

28 Aplicação das amostras
A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis possíveis. Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares.

29 As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto com o solvente durante o desenvolvimento do cromatograma. Alinhamento horizontal uniforme.

30 Preparação da cuba A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso, coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação. A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera interna.

31 Desenvolvimento de um cromatograma numa cuba
A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase móvel desejada

32 Revelação dos cromatogramas
A- Procedimentos Físicos: Luz ultravioleta (aromáticos ou dupla ligação conjugada). B- Procedimentos Biológicos e Enzimáticos: Antibióticos, Enzimas e Substratos. C- Procedimentos Químicos: Aplicação de um reativo químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.

33 Reveladores Físicos Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes. Ex: clorofila.

34 Reveladores Químicos Consiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis. Iodo Anisaldeído Ác. fosfomolibdico Tipos de reveladores químicos Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinato Flavonóides: NP-PEG Anti-oxidantes: β-caroteno Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico Antraquinonas e cumarinas: vapor de amônia Fenólicos, saponinas e terpenóides: vapor de iodo e solução de CeSO4 Compostos fenólicos: FeCl3

35 Reveladores Biológicos
Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível. Ex.: para testar se uma amostra contém substância anti-fúngica, revela-se o cromatograma com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas substâncias.

36 Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate factor)
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel. Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula. dr1 dm dr2 Ws1 Linha de chegada da FM Profundidade da FM Ponto de partida da amostra Ws2

37 Parâmetros Utilizados na Cromatografia Planar
Fartor de Retenção (Rf): Rf = dr / dm Resolução (Rs): Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2) Eficiência: n = 16 (dr – Ws)2

38 Desvantagens da CCD Difícil reprodutibilidade:
quantidade de amostra aplicada obtenção de cromatoplacas com características idênticas. Dificuldade de detecção devido à difusão da amostra Difícil determinação exata do Rf.

39 Constantes Físicas

40 Bibliografia COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed. Unicamp,Campinas,1995. NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005 THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001. Labjeduardo.iq.unesp.br COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed. Unicamp,Campinas,1995.

41 Agradecimentos Marquinho Alberto Camilo Alécio Amanda Coelho Danuello