Práticas microbiológicas

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1 Práticas microbiológicas
Escherichia coli “O que vale para E. coli vale para elefantes” Jacques Lucien Monod (1910 –1976) Práticas microbiológicas

2 Escherichia coli -Presente no intestino
-Caracterizada em 1855 pelo Dr Theodor Escherich Cepa O157:H7 patogênica a humanos Cepa K-12 comensal Auxilio nos estudos pioneiros da biologia molecular 100 mil publicações (Lederberg, 2004)

3 Escherichia coli Unicelular na forma de bastão
Cresce rapidamente a 37oC ciclo de 20 min Pouco exigente nutricionalmente Meio mínimo ou rico Glicose - melhor fonte de C Extrato de levedura - essenciais Triptona e Peptona: fonte aminoácidos

4 Escherichia coli Todas cepas derivam da K-12 Denominação
Nome do Laboratório e números representam sequencia de obtenção da cepa Cepas mais utilizadas (DH10, BL21, JM 109, HB 101, DH5a, XL blue,......) Nomenclatura para genes e marcas genéticas 3 letras em itálico ou sublinhado indica locus genético auxotrófico (his ou his -1) Varias enzimas usa letras maiúsculas para indicar locus (hisA, hisB) O fenótipo é escrito em letra maiúscula His+ ou His

5 Escherichia coli -DH10B F- endA1 recA1 galE15 galK16 deoR nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ- - BL21 (AI) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

6 Mapa de marcas e genético
pares de base Conjugação e mutantes auxotroficos Sequenciamento

7 Plasmídeo DNA extra cromossomial
São menores que o principal Alto replicativos tamanho de 1 a > 200 Kpb Determinam característica com resistência a antibióticos ou síntese de enzimas de restrição Deles derivam os vetores utilizados na biologia molecular Clonar fragmentos

8 Tipos de plasmídeos

9 Vetores de clonagem Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb
pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético

10 Vetores de clonagem Plasmídeo
Características para uso: origem de replicação marcadores de seleção resistência a antibiótico (ampR, tetR, CamR, KanR, ) gene lacZ - amino terminal b-galactosidase (complementa) IPTG e X - Gal sítio múltiplo de clonagem (MCS) tamanho (quanto menor melhor!) Manipulação após purificacão larga escala “mini-prep” ou lise alcalina

11 Clonagem

12 pBR322 Plasmídeos naturais pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1
1o plasmídeo -1977 Bolivar et al 1977 4363 pb Plasmídeos naturais pBR322 = R R pMB1

13 Seleção Transformação Placa Réplica

14 pUC8 1982 Vieira & Messing (pBR322 and M13mp8)

15 Plasmídeo pUC Mutanção no gene rop Sistema lacZ’ Adicionar ao meio
Permite um maior numero de copias por celula Sistema lacZ’ Adicionar ao meio IPTG = isopropil thio galactose X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-galactopiranosídeo (branco/azul)

16

17 Bactérias para Transformação
Células não apresentam fator de conjugação Não apresentam DNA plasmidial Precisam ser preparadas Tornar-se competentes Transformação Quimiotransformação Eletroporação F-

18 Prática Microbiológicas

19 Condições Estéril Ambiente de manipulação Regentes e meio de cultivo
Vidraria Práticas devem manter o ambiente estéril Fluxo Laminar

20 Cultivo e conservação Meio cultivo Indefinido definido
Consevação de microrganismos Meses – placa de petri a 4oC, tubo inclinado. 1ano – “stab” 4 ano – glicerol 15-20% a -70 oC DMSO entre 7-8% a -70 oC

21 Inoculação Inoculação Estoque ou de um cultivo

22 Isolamento Colônia isolada
formada a partir de 1 UFC (unidade formadora de colônia) Estoque ou de um cultivo Certificar da pureza do isolado

23 Curva de Crescimento Trabalhar com DNA recombinante priorizar fase exponencial (107 UCF, 109 UCFdificulta aeração) Inoculo inicial, colônia isolada, pré-cultivo (109), diluir de 10 ou 100 vezes, avaliar curva de crescimento por algumas horas

24 Curva de Crescimento

25 Pratica Microbiológicas-Contagem
Diluição Serial 1UCF entre 8-16hs forma uma colônia visível ao olho nu Absorbância nm 0,7 limite

26 Transferência horizontal de DNA