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Escherichia coli O que vale para E. coli vale para elefantes Jacques Lucien Monod (1910 –1976) Práticas microbiológicas.

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1 Escherichia coli O que vale para E. coli vale para elefantes Jacques Lucien Monod (1910 –1976) Práticas microbiológicas

2 Escherichia coli -Presente no intestino -Caracterizada em 1855 pelo Dr Theodor Escherich –Cepa O157:H7 patogênica a humanos –Cepa K-12 comensal –Auxilio nos estudos pioneiros da biologia molecular 100 mil publicações (Lederberg, 2004)

3 Escherichia coli Unicelular na forma de bastão Cresce rapidamente a 37 o C –ciclo de 20 min Pouco exigente nutricionalmente Meio mínimo ou rico –Glicose - melhor fonte de C –Extrato de levedura - essenciais –Triptona e Peptona: fonte aminoácidos

4 Escherichia coli Todas cepas derivam da K-12 Denominação –Nome do Laboratório e números representam sequencia de obtenção da cepa –Cepas mais utilizadas (DH10, BL21, JM 109, HB 101, DH5a, XL blue,......) Nomenclatura para genes e marcas genéticas -3 letras em itálico ou sublinhado indica locus genético auxotrófico (his ou his -1 ) -Varias enzimas usa letras maiúsculas para indicar locus (hisA, hisB) -O fenótipo é escrito em letra maiúscula His + ou His

5 Escherichia coli -DH10B F- endA1 recA1 galE15 galK16 deoR nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ- - BL21 (AI) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

6 pares de base Mapa de marcas e genético SequenciamentoConjugação e mutantes auxotroficos

7 Plasmídeo DNA extra cromossomial –São menores que o principal –Alto replicativos –tamanho de 1 a > 200 Kpb –Determinam característica com resistência a antibióticos ou síntese de enzimas de restrição Deles derivam os vetores utilizados na biologia molecular –Clonar fragmentos

8 Tipos de plasmídeos

9 Vetores de clonagem Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb –pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético

10 Vetores de clonagem Plasmídeo Características para uso: –origem de replicação –marcadores de seleção resistência a antibiótico (amp R, tet R, Cam R, Kan R, ) gene lacZ - amino terminal b-galactosidase (complementa) –IPTG e X - Gal –sítio múltiplo de clonagem (MCS) –tamanho (quanto menor melhor!) Manipulação após purificacão –larga escala –mini-prep ou lise alcalina

11 Clonagem

12 pBR322 1 o plasmídeo Bolivar et al 1977 Plasmídeos naturais pBR322 = R1 + R6.5 + pMB pb

13 Seleção Transformação Placa Réplica

14 pUC Vieira & Messing (pBR322 and M13mp8)

15 Plasmídeo pUC Mutanção no gene rop –Permite um maior numero de copias por celula Sistema lacZ Adicionar ao meio –IPTG = isopropil thio galactose –X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d- galactopiranosídeo (branco/azul)

16

17 Bactérias para Transformação Células não apresentam fator de conjugação Não apresentam DNA plasmidial Precisam ser preparadas –Tornar-se competentes Transformação –Quimiotransformação –Eletroporação F-F-

18 Prática Microbiológicas

19 Condições Estéril –Ambiente de manipulação –Regentes e meio de cultivo –Vidraria –Práticas devem manter o ambiente estéril Fluxo Laminar

20 Cultivo e conservação Meio cultivo –Indefinido –definido Consevação de microrganismos –Meses – placa de petri a 4 o C, tubo inclinado. –1ano – stab –4 ano – glicerol 15-20% a -70 o C DMSO entre 7-8% a -70 o C

21 Inoculação –Estoque ou de um cultivo

22 Isolamento Colônia isolada –formada a partir de 1 UFC (unidade formadora de colônia) –Estoque ou de um cultivo –Certificar da pureza do isolado

23 Curva de Crescimento Trabalhar com DNA recombinante priorizar fase exponencial (10 7 UCF, 10 9 UCFdificulta aeração) Inoculo inicial, colônia isolada, pré- cultivo (10 9 ), diluir de 10 ou 100 vezes, avaliar curva de crescimento por algumas horas

24 Curva de Crescimento

25 Pratica Microbiológicas-Contagem –Diluição Serial 1UCF entre 8-16hs forma uma colônia visível ao olho nu –Absorbância nm 0,7 limite

26 Transferência horizontal de DNA


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