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Técnica de DNA recombinante DNA recombinante ou clonagem ligar 2 ou + segmentos de DNA, gerando mólecula capaz de replicação autônoma em hospedeiro.

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1 Técnica de DNA recombinante DNA recombinante ou clonagem ligar 2 ou + segmentos de DNA, gerando mólecula capaz de replicação autônoma em hospedeiro

2 Técnica de DNA recombinante Base das técnicas de DNA recombinante –enzimas que modificam ácidos nucleicos –síntese, degradação, ligação ou remoção de partes dos ácidos nucleicos de forma controlada Enzimas DNA Polimerases Enzimas de restrição - corte Ligases - ligação Kinases e fosfatases - modificação de terminações (alteração de PO 4 )

3 E. coli Plasmídeo Digestão Eucarioto Ligação Transformação

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5 Escherichia coli Escherichia coli - patogênica a humanos cromossomo circular Kpb –http://wit.integratedgenomics.com/http://wit.integratedgenomics.com/ –http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/277/5331/1453http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/277/5331/1453 cepas derivadas de K-12 cepas + utilizadas –denominadas por uma ou mais letras + números –JM 109, HB 101, DH5, DH10, BL21, XL blue, cepas prototróficas ou auxotróficas

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7 Escherichia coli Cresce rapidamente a 37 o C (ciclo de 20 min) Meio mínimo ou rico –Glucose - melhor fonte de C –Extrato de levedura - essenciais –Triptona e Peptona: fonte amino ácidos Cepas de E. coli - sem plasmídeo Introdução de plasmídeo -> transformação –tratamento químico (PEG, CaCl 2 ) ou físico (eletroporação)

8 Vetores de clonagem Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb –pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET Fago lambda - ~0,1 a 18 Kb Cosmídeo - ~35 a 50 kb BAC e YAC - fragmentos maiores Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético

9 Vetores de clonagem Plasmídeos: DNA circular acessório, auto-replicativo e extra-cromossomial tamanho de 1 a > 200 Kpb Bacteriófagos ou fagos: viróides de bactérias capaz de replicação dentro de bactérias

10 Vetores de clonagem Plasmídeo Manipulação após purificacão –larga escala –mini-prep ou lise alcalina Características para uso: –origem de replicação –marcadores de seleção resistência a antibiótico (amp R e tet R ) gene lacZ - amino terminal -galactosidase (complementa) –IPTG e X - Gal –sítio múltiplo de clonagem (MCS) –tamanho (quanto menor melhor!)

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12 pBR322 1 o plasmídeo Bolivar et al 1977 Plasmídeos naturais pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1

13 pBR322

14 pUC Vieira & Messing

15 Plasmídeo Sistema lacZ Adicionar ao meio –IPTG = isopropil thio galactose –X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -d- galactopiranosídeo (branco/azul) Outros sistemas (pZERO)

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17 Vetores de clonagem Bacteriófago (fago) Ciclo de infecção: Lítico ou LisogênicoLíticoLisogênico Genoma de fago = 48,5 Kpb Cerca de 15 Kb opcional - necessário para integração no cromossomo de E. coli Deleção desse fragmento não afeta ciclo líticolítico Fago mantém ciclo lítico sem esse fragmento Dois tipos de vetores: –vetor de inserção: remoção DNA opcional –vetor de substituição: fragmento stuffer

18 Lítico Lisogênico

19 Bacteriófago (fago)

20 Vetores de clonagem Bacteriófago (fago) Genoma do fago é linear Terminações fita simples de 12 bases - COS - seqüências complementares -> pareamento Vetor fago pode ser circular Manipulado como plasmídeo e re-introduzido em E. coli por transfecção (baixa eficiência) Empacotamento in vitro: –2 braços lineares ligados a insertos –adicionar mix de empacotamento (capa ptn) –partículas fago espontânea: DNA de 37 a 52 Kb

21 Vetores de clonagem Bacteriófago (fago) Empacotamento in vitro:in vitro –2 braços lineares ligados a insertos concatâmeros –Adicionar mix de empacotamento (capa ptn) –Partículas de fago formam espontaneamente –DNA incluído de 37 a 52 Kb flanqueados por sítios COS –Misturar partículas de fago com E. coli –Plaquear as células - camada de bactérias –Lise de bactérias - plaqueplaque –fagos recombinantes -> restrição tamanho braços

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24 Vetores de clonagem Insertos maiores Plasmídeo - acomoda até 10 Kb –rearranjos ou interfere com replicação Fago - acomoda até 18 Kb Cosmídeo - plasmídeo contendo sitío COS –concatâmeros de moléculas pelo sítio COS –apenas COS para empacotamento de fago partícula reconhece apenas sítio COS –partículas de fago com cosmídeo - infectivas –replicação como plasmídeo - colônias –35 a 50 kb, conforme cosmídeo (< 8 Kb) máx 52 kb

25 Z = tamanho médio do inserto em pb G = tamanho do genoma haplóide em pb Manual

26 Cosmídeo pJB 8

27 Vetores de clonagem Insertos maiores YACs (yeast artificial chromosome) (Burker et al 1987) –Mantido em S. cerevisiae –Cromossomos - centrômero, telômero e origem de replicação –plasmídeo de Kb –cromossomo original de 230 a 1700 Kb –acomoda até 600 Kb, máx 1400 Kb –grande problema de estabilidade e rearranjos uso de outros vetores menos instáveis mas acomodando fragmentos menores

28 YAC

29 Vetores de clonagem Insertos maiores Bacteriófagos P1 ou P1 (Sternberg 1990) similar ao fago versão com deleções do fago natural fago maior e acomoda fragmentos maiores acomoda até 125 Kpb BAC (bacterial artificial chromosome) (Shizuya et al 1992) baseado no plasmídeo natural F clonagem de até 300 Kbp

30 Vetores de clonagem Insertos maiores PAC (P1 derived artificial chromosomes) (Ioannou et al 1994) combina características de fagos P1 e BACs clonagem de até 300 Kbp Fosmídeos (Kim et al 1992) contém a origem de replicação do plasmídeo F e sítio COS de fago similar a cosmídeos menor número de cópias por célula - < rearranjos

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32 Vetores de clonagem outros organismos Existem vetores específicos para manipulações em outros organismos outras bactérias S. cerevisae Camundongos Plantas - pBIN 19, série pCAMBIA

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35 Enzimas de Restrição –Endonucleases de restrição –Bacteriófagos - > vírus infectam bactérias –1950s - fagos infectam cepas específicas certos fagos restritos a certas cepas (Luria) – endonuclease clivam DNA não protegido DNA não protegido degradado por endonuclease restringindo infecção – purificação 1 a endonuclease de restrição – purificação e caracterização Hin dII corte mesmo sítios - mapa de restrição Simian Virus 40

36 Enzimas de Restrição Organismos possuem sistema de Restrição e Modificação associados Modificação - metilação de bases Enzimas de restrição ocorrem bactérias, vírus, alga eucarionte Chlorella

37 Enzimas de Restrição Tipos de Enzimas de Restrição/Modificação: –Tipo I - Restrição e Modificação na mesma enzima com 2 ou 3 subunidades heterólogas –Tipo II - sistema R e M separados Homodímeros 93% das comerciais, outros 5% Tipo IIs –Tipo III - R e M na mesma enzima

38 Tipos de Enzimas de Restrição Tipos de Terminação

39 Enzimas de Restrição Enzimas de Restrição Tipo II –reconhecem sítios palindrômicos - 4 a 8 bases –cortam no interior da seqüência –enzimas R e M adjacentes no genoma de origem –requerem Mg 2+ –normalmente produzem 5-fosfato e 3-OH –Tipo IIs -possui sítio de reconhecimento rara/ palindrômico (4 a 7 bases) e corta abaixo (até 20 pb)

40 Tipos de Enzimas de Restrição Tipos de Terminação

41 EnzimaSeqüência ReconhecimentoTipo TerminaçãoSeqüências Finais AluI5-AGCT-3Blunt5-AG CT-3 3-TCGA-53-TC GA-5 Sau3AI5-GATC-3Sticky, 5 overhang5- GATC-3 3-CTAG-53-CTAG -5 HinfI5-GANTC-3Sticky, 5 overhang5-G ANTC-3 3-CTNAG-53-CTNA G-5 BamHI5-GGATCC-3Sticky, 5 overhang5-G GATCC-3 3-CCTAGG-53-CCTAG G-5 BsrBI5-CCGCTC-3Blunt5- NNNCCGCTC-3 3-GGCGAG-53- NNNGGCGAG-5 EcoRI5-GAATTC-3Sticky, 5 overhang5-G AATTC-3 3-CTTAAG-53-CTTAA G-5 PstI5-CTGCAG-3Sticky, 3 overhang5-CTGCA G-3 3-GACGTC-53-G ACGTC-5 NotI5-GCGGCCGC-3Sticky, 5 overhang5-GC GGCCGC-3 3-CGCCGGCG-53-CGCCGG CG-5 BglI5-GCCNNNNNGGC-3Sticky, 3 overhang5-GCCNNNN NGGC-3 3-CGGNNNNNCCG-53-CGGN NNNNCCG-5

42 Enzimas de Restrição Nomeclatura –Nome específico do organismo: –1 a letra o gênero + 2 letras espécie = 3 letras –próximo letra da identificação da cepa –numeral romano indica ordem de identificação Escherichia coli = Eco R I Haemophilus influenza = Hin d III

43 Enzimas de Restrição Sítios de Reconhecimento de Tipo II –palíndrome de 4 a 8 base com eixo rotacional de simetria EcoRI - GATTC –interrompido SfiI - GGCCNNNNNGGCC AccI - GTMKAC - M = A ou C; K = G ou T Sítio de Reconhecimento Tipo IIs Mbo II - GAAGA cortando 8 bases 3 e 7 bases 5

44 Enzimas de Restrição Enzimas de restrição

45 Enzimas de Restrição Reação de Digestão ou Restrição Tampão típico: –MgCl 2 - requerimento absoluto –NaCl ou KCl - força iônica –Tris-Cl - manutenção pH – -mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT) - estabilização –BSA - estabilização Específico para cada enzima Problema - digestão ou reação múltiplas

46 Enzimas de Restrição Tampão UNIVERSAL: –Glutamato de Potássio –afeta eletroforese –*Acetato de Potássio –Tris-acetato –baseado em análises de tampões celulares One-Phor-ALL - Amersham Multi-core - Promega Várias enzimas mantêm atividade –T4 DNA ligase, T4 DNA polimerase

47 Enzimas de Restrição Reação –1 unidade - 1 g de DNA –DNA - s/ contaminações de fenol, álcool, detergentes, EDTA, sais, polissacarídeos –estoque com 50% glicerol - máx 10% volume de reação glicerol não pode ultrapassar 5% do volume –parar reação - adicionar EDTA, aquecer (65 o C) ou extrair com fenol:clorofórmio –enzimas mantidas máximo de tempo a -20 o C (RT) –evitar contaminação

48 Enzimas de Restrição Atividade não específica - STAR sob condições não padronizadas extremas enzimas perdem especificidade de sítio específico para cada enzima –alta concentração de glicerol = >5% –alta relação U de enzima/ g DNA = >100 U/ g –Baixa força iônica (< 25 mM) –Alto pH (>8,0) –presença solventes ôrganicos (DMSO, etanol, EG) –substituição de Mg 2+ por cátions (Mn, Cu, Zn, Co)

49 Enzimas de Restrição

50 Enzimas de Clonagem LIGASES ligar ou juntar ácidos nucleicos –clonagem de fragmento de DNA em vetor FOSFATASES remover grupo 5 fosfato de fitas de DNA –prevenir de re-ligação de vetor –produzir substrato para quinase adicionar 32 PO 4 QUINASES (Kinases) adicionar grupos fosfato - marcação 32 P

51 Ligases T4 DNA ligase: ligar ou juntar ácidos nucleicos –clonagem de fragmento de DNA em vetor 5 P 5 3 OH 3 5 P 5 3 OH OH Mg 2+, ATP

52 Papel in vivo

53 Ligases Função biológica: –produzida por fago T4 em E. coli –ligar intervalos na replicação de DNA (Okazaki) –reparo de DNA e recombinação Catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre nucleotídeos e hidrólise de ATP->AMP + PPi DNA ligase: age em dsDNA ou RNA em duplex –ligação em terminais coesivos ou abruptos ou nicks RNA ligase: age em ssRNA ou ssDNA/RNA

54 Ligases Ligase catalisa a ligação de segmentos de DNA ou RNA formando ligações fosfodiéster entre 3 OH e 5 fosfato Requer fonte de energia - ATP Ligação entre terminais abruptos ou coesivos...TGGTATCTGTGTGACTGAT OH P TAGCAGGCCATCC ACCATAGACACACTGACTA P OH ATCGTCCGGTAGG.....CTTGATGGTATCTGTGTG OH P AATTCCTCAAGAACTGGACTTC....GAACTACCATAGACACACTTAA P OH GGAGTTCTTGACCTGAAG..

55 Ligases

56 T4 DNA de bacteriófago = comumente usada na construção de recombinantes Requer ATP como co-fator –Não utiliza NAD (E. coli DNA ligase) –usada em quebras ou ligação coesivas e não abruptas Para reações intermoleculares requer que uma possua 5-fosfato Usada ligar ssDNA (oligos) adjacentes - mutagênese sítio dirigida

57 Linkers x adaptadores abrupto -> coesivo digestão Homopolímero tailing terminal deoxinucleotidil transferase DNA polimerase independe/ terminal deoxinucleotidil transferase calf thymus

58 Fosfatase Remover o grupo fosfato 5 –Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP) prevenir re-ligação de vetor de clonagem produzir substrato para quinase 5 P 3 OH OH 3 P 5 5 OH 3 OH OH 3 OH 5

59 Fosfatase Uso retirar grupo fosfato dos terminais 5 do vetor para prevenir auto-ligação durante clonagem –apenas uma fita precisa estar ligada antes de introduzir plasmídeo na bactéria inserto não deve estar desfosforilado remoção de fosfato - melhora marcação Mais usada: Calf Intestinal alkaline phosphatase (CIAP)

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61 Kinase Adicionar novos grupos fosfatos a ácidos nucleicos (ex. marcação radioativa) –T4 Polynucleotide kinase Permite troca de grupos fosfatos 5 *P 3 OH OH 3 Mg 2+, [ - 32 P] ATP P* 5 5 OH 3 OH OH 3 OH 5

62 Kinase 5 *P OH 3 Mg 2+, [ - 32 P] ATP 5 OH OH 3 5 *P OH 3 ADP, Mg 2+, [ - 32 P] ATP 5 P OH 3

63 Kinase Uso transfere grupo -fosfato de nucleotídeo trifosfato (ATP) para o terminal 5 usada para fosforilar DNA sintético para facilitar ligação marcação de sondas com [ - 32 P]ATP capacidade de troca de fosfato P-5 -> 32 P-5 Mais usada: T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)

64 Kinases

65 Clonagem ETAPAS 1. Preparação do vetor 2. Ligação do vetor e inserto 3. Transformação de hospedeiro 4. Seleção de clones

66 Preparação do vetor Digerir plasmídeo purificado com 2 enzimas de restrição do MCS –gerar terminais compatíveis com inserto –clonagem direcionada –coesivo + abrupto = 2 a opção

67 Preparação do vetor Ausência de sítio de enzima no inserto –digerir com enzima e tornar abrupto –usar Klenow (DNA polimerase I) ou T4 DNA polimerase para preencher 5 proeminente atividade polimerase 5-> 3 –usar T4 DNA polimerase para remover 3 proeminente atividade exonuclease 3-> 5 na presença de dNTPs AATTCCTCAAG DNA polimerase I + dNTPs > AATTCCTCAAG OH GGAGTTC T4 DNA Polimerase OH TTAAGGAGTTC

68 Preparação do vetor Estratégia alternativa: –usar ligar linkers às extermidades com sítio de restrição desejado Clonagem de produto de PCR –Usar sítios de restrição no primer 4 nt do terminal 5 para permitir digestão –Usar artefato de adicionar extra Adenina no 3 pela Taq polimerase (ausência 3-> 5 exonuclease) –vetor contém extra Timina no 3 (ex. pGEM-T)

69 Preparação do vetor Ligação com terminação abrupta ou enzima de restrição única -> defosforilar Prevenir auto-ligação do vetor –CIAP - 0,01 unidades/picomole de terminação – g DNA x 3,04 = pmoles de terminação (kb do DNA) Inserto deve estar fosforilado no 5 –fragmentos de digestão - OK –produto de PCR ou sintético - fosforilar

70 Preparação do vetor Purificar inserto e vetor –Vetor não digerido - falsos transformantes Purificar por gel eletroforese –kits comerciais –saco de diálise

71 Ligação Eficiência avaliada por # transformantes Condições: –relação molar inserto: vetor (3:1 a 1:3) (ng de vetor x tamanho inserto em kb) x (inserto:vetor) tamanho vetor kb –total de DNA –tamanho do inserto –unidades de ligase –concentração de ATP e Mg 2+ –tempo e temperatura de incubação

72 Ligação Total de DNA em reação de ligação: –1 a 10 ng/ l reação (10 a 200 ng total em 20 l) –ligações mais difíceis - mais DNA Condições: –balanço entre tempo e temperatura (ótimo 25 o C) –função tipo de terminação - função da Tm coesivo = o C por 3 a 16 hs abrupto = 4-16 o C por 4 a 18 hs em geral = 20 o C por 30 minutos

73 Ligação Reação de ligação: –requer [ATP] = 0,01 a 1 mM - muito lábil! –não descongelar muito e vortexar - gradiente –requer 10 mM MgCl 2 EDTA quela - inibe atividade da T4 DNA Ligase ativa nucleases - cepas que não são endA- –tratar com fenol-clorofórmio Controles: –apenas plasmídeo - taxa de religação –apenas inserto - contaminação

74 Transformação e Seleção Eficiência –ufc na placa x 10 3 ng x diluição = ufc ng de vetor g g DNA Ex. 100 l céls. em 1 ng plasmídeo 10 l solução (0,1 ng) em 990 l SOC 100 l plaqueado = 100 colônias plasmídeo não digerido -> 10 9 ufc/ g ligação abrupta -> 10 5 ufc/ g ligação coesiva -> 10 6 ufc/ g


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