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Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP (e de Nitrosação também)

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1 Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP (e de Nitrosação também)

2 Células endoteliais Hemácias Células musculares lisas Vaso sanguíneo vasodilatação Vasoconstrição agregação antiagregação Fat. trombogênicos Fat. anticoagulantes Fat. mitogênicos Inib. crescimento

3 Vasodilatação produzida pelo NO endógeno Ignarro et al. - Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 9265 EDRF = NO Furchgot, Ignarro and Murad – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina Ach + Ca Ca 2+ e-NOS O 2 + L-Arginina NO + L-Citrulina NO GC GTPcGMP Relaxamento Células endoteliais Células musculares lisas

4 SISTEMA DIGESTIVO Promove a dilatação estomacal Ativa os movimentos peristálticos NO SISTEMA NERVOSO Neurotransmissor Inibição da contração da musculatura lisa Plasticidade neuronal Memória de longo prazo SISTEMA MUSCULAR Regula o tônus muscular Vasodilatação localizada SISTEMA IMUNOLÓGICO Agente bactericida Inibe a replicação de vírus Destoi células tumorais SISTEMA CIRCULATÓRIO Vasodilatação de veias e artérias Controle da pressão sanguínea Liberação de O 2 a partir da HbO 2 Controle do fluxo sanguíneo nos rins Funções bioquímicas do NO

5 Oxido Nítrico 2s s * s b N atomic orbital O atomic orbital Diagrama de Orbitais Moleculares do NO

6 By: Steven Hunt, June 18, 1997 You've just cut your finger on the edge of a piece of paper. In a flash, you stick your finger in your mouth, thinking that will make it better. Well…your hunch is not that far off. In fact, licking your wounds is one of those instinctive things most people don't think about much, but according to researchers in Britain, it's not only instinctive. It has healing properties to boot.In the same way that dogs and other animals are often seen licking their wounds, humans too, it's been found, can do better by licking their injuries than by leaving them alone. Dr. Nigel Benjamin, a clinical pharmacologist with St. Bartholomew's and the London School of Medicine and Dentistry, has discovered that it all comes down to how saliva reacts with skin."We'd been looking at nitrite in saliva for some time," Benjamin states, "mainly because we'd been interested in nitric oxide and its effects in disease processes." That's because nitric oxide - the compound that results when saliva interacts with the skin - has for several years been known to play a role in the body's fight against germs. But Benjamin and his London colleagues were interested in finding out whether licking your wounds had any real effect on the healing process."We looked at the comparison of what happens when you use saliva to wet your skin compared to just normal saline," Benjamin explains. "And we found that the saliva produces loads of nitric oxide." With nearly 10 times the amount of nitric oxide on licked skin compared to non-licked skin, Benjamin says, "there is a definite function for this nitric oxide in order to protect us when we wound ourselves from contamination by unwanted bacteria."Steven Hunt Scientists discover a reason to lick your wounds By: Steven Hunt, June 18, 1997Steven Hunt

7 Ações do NO no Sistema Imunológico Macrófagos Neutrófilos 2NO + O 2 = 2 NO 2 = N 2 O 3 N 2 O 3 + H 2 O = 2 HNO 2 = 2 NO H + NO 3 - NO em excesso choque séptico

8 AÇÃO CITOTÓXICA DO NO CONTRA BACTÉRIAS VÍRUS E CÉLULAS TUMORAIS Inativação de enzimas: -do ciclo de Krebs -da síntese de DNA -de funções mitocondriais APOPTOSE NECROSE NO Reação com: -Centros Fe-S (Fe 4 S 4 ) - RSH - R-tirosila Desaminação do DNA Oxidação de membranas

9 Fe - NO NO + Fe(II) ou Fe(III) (NITROSILAÇÃO) R-SNO O 2 /Cu 2+ /O 2.- NO + R-SH (NITROSAÇÃO) NO + R-NH 2 O 2 /Cu 2+ /O 2.- R-NNO NO = ligante nitrosila CO = ligante carbonila -SNO = NITROSOTIOL -NNO = NITROSAMINA

10 NO, Superóxido e Peroxinitrito NO + O 2. - ONOO - NOO2.-O2.- Oh NO !! ONOO - em excesso choque séptico ONOO - + H + NO 2. + OH.

11 Ativação da Guanilato Ciclase solúvel: Uma reação de NITROSILAÇÃO

12 ATEROSCLEROSE DISFUNÇÃO ENDOTELIAL DISFUNÇÃO ENDOTELIAL Hipertensão Oclusão arterial Vasoespasmo Falha na regulação da produção endógena de Óxido Nítrico (NO)

13 Nitratos de Isosorbida [Fe(CN) 5 NO] 2- GC GTP cGMP Células Endoteliais Células musculares lisas GTP cGMP Relaxamento NO GC NO Doadores exógenos de NO

14 Nitroprussiato de sódio Shishido, SM, de Oliveira MG, Prog. React. Kinetic Mech. 26, 239, 2001

15 II + e-e-

16 NO NPS red NO NPS CN NPS CN NPS red 2089 [Fe II (CN) 5 H 2 O] % Transmitância Número de onda / cm NPS + cisteina (pH 7.4) Variação espectral no IV

17 [Fe II (CN) 5 NO + ] 2- + RS - [Fe II (CN) 5 H 2 O] 3- + NO + 1/2 RSSR (Aquoferrocianeto) 2038 cm -1 [Fe I (CN) 5 NO + ] /2 RSSR (NPS reduzido) 2089 cm -1

18 300 0,1 0,2 0,3 Absorbância Comprimento de onda / nm Espécie transiente 521 [Fe II (CN) 5 H 2 O] NPS + cisteina (pH 10) Variação espectral (UV/VIS)

19 ADUTO INTERMEDIÁRIO NO ATAQUE NUCLEOFÍLICO DO ÂNION TIOLATO AO NO DO NPS

20 MODELO ANIMAL RATOS WISTAR: - Normotensos - Agudamente hipertensos (L-NAME ) Pressão arterial Média (MAP) (Artéria femural) Infusões intravenosas de: NACNPS +

21 QUEDA DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA ( MAP) APÓS A INFUSÃO DE NPS e (NPS + NAC) Normotensos hipertensos Ricardo, KF, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biology and Chemistry: 7, 57, 2002

22 - S - H + NO H2OH2O - S

23 S-NITROSOTIOIS (RSNOs) S-nitroso-L-cisteina 181 Å 3

24 Sintetizando S-nitrosotiois NO gás Solução de tiól ÃO ACONTECE NADA!!!N

25 Oxido Nítrico 2s s * s b N atomic orbital O atomic orbital Diagrama de Orbitais Moleculares do NO NO + RSH RSNO + H + + e -

26 2 NO + O 2 2 NO 2 N 2 O 4 NO N2O3 N2O3 O 2 N-NO O 2 N - NO + O 2 N - NO + + RS - H + RS-NO + H + NO 2 - S-NITROSAÇÃO DE TIOIS

27 HO - N O + + RS -H + S-NITROSAÇÃO DE TIOIS EM SOLUÇÃO AQUOSA 4NO + O RSH 4RSNO + 2 H 2 O N 2 O 3 + H 2 O 2 HNO 2 2 HO - N O + 2H + + 2NO 2 - RS-NO + H 2 O

28 Sistema de nitrosação PATENTE REQUERIDA (INPI, 2001)

29 S-nitrosotiois: Transições eletrônicas n N * (Anti) n N * (Syn) *

30 Absorbância Comprimento de onda / nm Abs. em =545 nm Tempo/ s Controle da síntese de S-nitrosotiois por borbulhamento

31 Estruturas dos S-nitrosotiois sintetizados S-nitrosocisteina (CisNO) S-nitroso-N-acetilcisteina (SNAC) S-nitrosoglutationa (GSNO)

32 Dose-resposta da PAM na administração de SNAC em ratos NORMOTENSOS AGUDAMENTE HIPERTENSOS (L-NAME)

33 POTÊNCIA E DURAÇÃO DO EFEITO HIPOTENSOR DA SNAC E DO NPS EM RATOS WISTAR NORMOTENSOS Ricardo, K F, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biol.and Chem. 7, 57 (2002) Azul de Met. Potência Duração do efeito

34 Proteína S - H + NO RS-NO SNO R-S H S

35 Ratos Wistar - Diabéticos (ob/ob) - Nocaute iNOS (C57BL/6) (controle + Dieta hipercolesterolêmica –24 semanas) MODELO ANIMAL Efeito da administração de GSNO na nitrosação do receptor de insulina (Modelo de Resistência à Insulina)

36 ATEROSCLEROSE RESISTÊNCIA À iNSULINA RESISTÊNCIA À iNSULINA DIABETES TIPO 2 DISLIPIDEMIA HIPERTENSÃO AUMENTO NA PRODUÇÃO DE iNOs

37 Ligação da Insulina ao Receptor de insulina trans-membrana Receptor de insulina Membrana plasmática Insulina

38 Autofosforilação dos resíduos de tirosina do receptor de Insulina Membrana plasmática

39 Cadeia A da InsulinaCadeia B da Insulina

40 Monômero da Insulina

41 Nitrosação da subunidade do Receptor de Insulina RS-NO -RSH - RS-NO RS-H S

42 Detecção da nitrosação do receptor de insulina pelo Método fluorimétrico DAN/NAT 2 (Receptor - S-NO) (Receptor- S – S - Receptor) + 2 NO 2 NO + O 2 2 NO H 2 O 2 HNO 2 HgCl 2 HNO 2 2,3 naftotriazol (NAT) pH min, 37 C pH H+H+ excit = 375 nm

43 Espectro de emissão do Naftotriazol e curva de calibração com NO 2 - Limite de detecção: < 5 nmol L -1

44 Detecção da nitrosação dos substratos de receptores de Insulina (IRS1) em imunoprecipitados (ratos ob/ob) Carvalho-Filho, M.A., Ueno, M., Seabra, A.B., Carvalheira, B.C., de Oliveira, M.G., Veloso, L.ª, Curi, R., Saad, M.J.ª, J. Biol Chem Submetido

45 Efeitos da GSNO na: atividade da tirosina-quinase, captação de glicose e síntese de glicogênio

46 COLABORAÇÕES FCM/UNICAMP IB/UNICAMP Prof. Mário Saad Profa. Marta H. Krieger Prof. Francisco R.M. Laurindo INCOR/USP ICB/USP Profa. Sílvia R.B.Uliana UNIV. EDINBURGO Prof. Richard Weller FM/USP Profa. Claudia P.M.S de Oliveira


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