PROJETO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

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1 PROJETO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
Vacina Oral Anti-coccídica Veiculada em Lactobacillus sp para Imunização de Frangos de Corte Depto Biologia Geral Depto Microbiologia Depto Bioquímica-Imunologia Depto Medicina Preventiva Depto Tecnologia e Inspeção UNEB

2 Introdução Coccidiose aviária é uma doença parasitária gastrointestinal debilitante e às vezes fatal. Agente etiológico – protozoários parasitas apicomplexa do gênero Eimeria (9 espécies). Prejuízos em granjas da ordem de US$ 1,5 bilhões anuais. US$ 60 milhões só no Brasil.

3 Anatomia da galinha

4 Localização da infecção
Sítios de infecção em Gallus gallus domesticus Espécie Ciclo (d) Localização da infecção E. acervulina 5 Alça duodenal e intestino delgado superior E. praecox 4 E. mitis Intestino delgado E. maxima 7 E. necatrix Intestino delgado e cecos E. tenella Cecos E. brunetti 6

5 CICLO DE VIDA

6 Lesão causada por Eimeria tenella em ceco.

7 Objetivos Isolamento e seleção de cepas de Lactobacillus spp. com elevada capacidade de adesão em porções definidas do trato gastrointestinal de aves de corte; Identificação e clonagem de genes de coccídios com potencial imunogênico. Construção de vetores para expressão de proteínas heterólogas (antígenos) em lactobacilos isolados de frangos; Imunização experimental de aves com lactobacilos recombinantes expressando antígenos de coccídios. Avaliação dos parâmetros imunológicos nas aves vacinadas após desafio; Produção em escala industrial das bactérias recombinantes e testes-piloto de imunização de frangos em granjas.

8 Endereçamento celular
Construção plasmidial do cassete de expressão de proteínas antigênicas de Eimeria Endereçamento celular Ancorada Secretada DNA Intracelular

9 Construção plasmidial do cassete de expressão de proteínas antigênicas de Eimeria

10 Eritromicina (1,2 kb) L GFP (720pb) Ancora (600pb) (344) BamH I Apa I
Xho I EcoR V / EcoR I Hind III Bst XI Promotor t7 – M13 Forward LacZ α ATG - M13 Reverse

11 Vacina Oral Anti-coccídica Veiculada em Lactobacillus sp para Imunização de Frangos de Corte
Isolamento, Identificação Molecular e Modificação Genética de Lactobacilos de Frangos João Luiz Silva Moreira Álvaro Cantini Nunes / Jacques R. Nicoli

12 Frangos abatidos precocemente (criação intensiva)
Avicultura Frangos abatidos precocemente (criação intensiva) Aditivos alimentares (antimicrobianos e promotores de crescimento) Alteração da microbiota Depressão imunológica Resíduos indesejáveis

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14 UTILIZAÇÃO DE PROBIÓTICOS (Suplemento com microorganismos vivos)
Alternativa! UTILIZAÇÃO DE PROBIÓTICOS (Suplemento com microorganismos vivos) Melhoram o equilíbrio microbiano intestinal Como? Exclusão competitiva; Modulação imunológica; Inibição da ação de toxinas; Produção de metabólitos bactericidas (AL, H2O2).

15 PRINCIPAIS GÊNEROS DE BACTÉRIAS DO ÁCIDO LÁTICO

16 Objetivos Isolamento de lactobacilos de frangos caipira e de granja;
Identificação Molecular por PCR-ARDRA dos espaçadores 16S-23S rRNA; Seleção de isolados de lactobacilos com propriedades probióticas; Transformação dos lactobacilos nativos com plasmídio repórter expressando GFP.

17 Metodologias para determinação de polimorfismos genéticos
PCR GENE-ESPECíFICO: amplificação específica de genes polimórficos RAPD: amplificação aleatória de polimorfismos ARDRA: digestão com enzimas de restrição de genes polimórficos (p.ex., ITS 16S-23S rDNA) DGGE/SSCP: diferenciação dos genes por diferenças na composição de bases (p.ex., 16S rDNA) REP-FINGERPRINTING: amplificação por PCR de elementos repetitivos bacterianos (p.ex., GTGn)

18 PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Molecular Diversity of Lactobacillus spp. and Other Lactic Acid Bacteria in the Human Intestine as Determined by Specific Amplification of 16S Ribosomal DNA H.G.H.J. HEILIG, E.G. ZOETENDAL, E.E. VAUGHAN, P. MARTEAU, A.D.L. AKKERMANS and W.M. DE VOS APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,.68(1): 114–123 (2002)

19 PCR-DGGE da Região V3 do Gene 16S de Bactérias do Ácido Lático
a = Pediococcus acidilactici DSM b = Pediococcus pentosaceus DSM c = Enterococcus casseliflavus ATCC d = Enterococcus durans ATCC e = Enterococcus faecalis ATCC f = Enterococcus faecium ATCC g = Lactobacillus sakei DSM h = Lactobacillus curvatus LTH 1432 i = Lactobacillus casei ATCC 334 j = Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis DSM k = Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM l = Lactobacillus helveticus ATCC m = Lactobacillus plantarum NCDO 1193 n = Leuconostoc mesenteroide subsp. mesenteroides DSM o = Lactococcus lactis subsp. lactis DSM p = Lactococcus lactis subsp. cremoris DSM 4645 q = Lactococcus lactis subsp. hordniae DSM r = Lactococcus garvieae DSM s = Leuconostoc lactis DSM t = Weissella paramesenteroides DSM u = Streptococcus thermophilus CNRZ 302

20 PCR-SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)
Applied and Environmental Microbiology, 66(3): (2000) Succession of Microbial Communities during Hot Composting as Detected by PCR-Single-Strand-Conformation Polymorphism-Based Genetic Profiles of Small-Subunit rRNA Genes Sabine Peters, Stefanie Koschinsky, Frank Schwieger, and Christoph C. Tebbe Os primers PCR foram desenhados para amplificar as regiões V4 e V5 hipervariáveis eubacterianas dos genes 16S rDNA

21 RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA)
Identification and Phylogenetic Analysis of Lactobacillus Using Multiplex RAPD-PCR A.K. DAUD KHALED, B.A. NEILAN, A. HENRIKSSON, P.L. CONWAY FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 153: (1999)

22 PCR-ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)
Journal of Clinical Microbiology, 39(10): (2001) Identification of Clinical Isolates of Actinomyces Species by Amplified 16S Ribosomal DNA Restriction Analysis Val Hall, P. R. Talbot, S. L. Stubbs, and B. I. Duerden HaeIII HpaII

23 Comparação das sequências de DNA da região intergênica 16S-23S rDNA
Identification of Lactobacillus Isolates from the gastrointestinal Tract, Silage, and Yoghurt by 16S-23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region Sequence Comparisons G. W. TANNOCK, A. TILSALA-TIMISJARVI, S. RODTONG, J. NG, K. MUNRO, AND T. ALATOSSAVA APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 65 (9): 4264–4267, 1999. SSU rDNA operon espaçador 16S-23S 23S-5S 16S 23S 5S

24 Amplificação das Regiões ITS do rDNA de Diferentes Lactobacillus sp
PCR ITS 16S-23S SSU rDNA Diversidade Microbiana em Amostras de fezes humanas Purificação de gel de agarose do fragmento de 500 pb da PCR 16-23S SEQUENCIAMENTO

25 Identificação Molecular
SSU rDNA operon Primer senso (16S): 5'-GAATCGCTAGTAATCG-3' Primer Reverso (23S): 5'-GGGTTCCCCCATTCGGA-3'

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27 Resultados Identificação Molecular por PCR-ARDRA dos espaçadores 16S-23S rDNA 3G14C (Lactobacillus reuteri) 1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII

28 3G14L (Lactobacillus johnsonii)
1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII 3G14L (Lactobacillus johnsonii) 2G14E (Lactobacillus acidophilus ) 5G14L (Lactobacillus crispatus)

29 4G14C (Lactobacillus vaginalis)
1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII 4G14C (Lactobacillus vaginalis) 2GB26 (Lactobacillus salivarius) 1AC41 (Lactobacillus agilis)

30 Seleção das cepas de Lactobacillus sp com propriedades probióticas
Seleção de cepas com resistência a suco gástrico

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32 2. Seleção de cepas com resistência a sais biliares

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34 3. Teste de Hidrofobicidade
Isolado Espécie Hidrofobicidade (%) 1M14C L. reuteri 89 5D14E L. acidophilus 83 1M14E L. johnsonii 35 2G14E 55 2M14C 58 3G14C 67 2M14L 52 3G14L 45 3M14C 42 4G14C L. vaginalis 25 3M14L 61 4G14L 4M14C 64 5G14C L. salivarius 66 4M14L 36 5G14L L. crispatus 5M14C 78 2C14E 1D14C 60 2C14L 2D14C 3C14C 84 2D14E 76 3C14L 3D14C 4C14C 92 3D14L 88 5C14C 4D14C 5C14E

35 Futuro... Seleção de cepas com capacidade de adesão à epitélio intestinal ou muco; Teste de colonização em modelo murino gnotobiótico; Capacidade de transferência de resistência (in vitro e in vivo); Transformação dos lactobacilos nativos com plasmídio repórter expressando GFP.

36 Lactobacillus delbrueckii
Identificação Molecular de isolados vaginais humanos Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus rhamnosus

37 Identificação Molecular de isolados vaginais humanos
Lactobacillus gasseri Lactobacillus fermentum

38 Referências BARROW, P.A. Probiotics for chickens. In: Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992, p. 225–257. CERQUEIRA, M.M.O.P. Isolamento, seleção e efeitos de um probiótico na modulação da infeccção por Eimeria acervulina e no desempenho de frangos de corte. Belo Horizonte: UFMG, p. (Tese de Doutorado). CUNNINGHAM-RUNDLES, S., AHRNE, S., BENGMARK, S., JOHANN-LIANG,R., MARSHALL, F., METAKIS, L., CALIFANO, C., DUNN, A.M., GRASSEY, C., HINDS, G. AND CERVIA, J. (2000) Probiotics and immune response. Am. J. Gastroenterol. 95, S22-S25. FULLER, R. Nature of the determinant responsible for the adhesion of lactobacilli to the chicken crop epithelial cell. Journal of General Microbiology, v. 87, p. 245–250, 1975. FULLER, R. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, v. 66, p. 365–378, 1989. GEOFFROY M-C, GUYARD C, QUATANNENS B, PAVAN S, LANGE M, MERCENIER A: Use of green fluorescent protein to tag lactic acid bacterium strains under development as live vaccine vectors. Appl Environ Microbiol 2000, 66: KOS B, SUSKOVIC J, VUKOVIC S, SIMPRAGA M, FRECE J, MATOSIC S: Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J Appl Microbiol 2003, 94:

39 Referências MAIOLINO, R.A., FIORETTI, M.L.F., MEO, C. Research on the efficiency of probiotics in the diet for broiler chickens. Nutrition Abstract Review, series B, v. 62, p. 482, 1992. MOREIRA JLS, MOTA RM, HORTA MF, TEIXEIRA SMR, NEUMANN E, NICOLI JR, NUNES AC: Identification to the species level of Latobacillus isolated in probiotic prospecting studies of human, animal or food origin by 16S-23S rRNA restriction profiling. BMC Microbiol 2005, 5:15. RANA, R., AKHTAR, M.S., NAWAZ, M. Residues of sulfaquinoxaline in poultry products. Pakistan Veterinary Journal, v. 45, p. 161–166, 1993. SERROR P, SASAKI T, EHRLICH D, MAGUIN E: Eletrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. Lactis with various plasmids. Appl Environ Microbiol 2002, 68:46-52. TILSALA-TIMISJARVI A, ALATOSSAVA T: Development of oligonucleotide primers from the 16S-23S rRNA intergenic sequences for identifying different dairy and probiotic lactic acid bacteria by PCR. Int J Food Microbiol 1997, 35:49-56. WALKER DK, GILLILAND SE: Relationships among bile tolerance, bile salt desconjugation, and assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. J Dairy Sci 1993, 76: