A Saliva de Insetos Hematófagos

Apresentação em tema: "A Saliva de Insetos Hematófagos"— Transcrição da apresentação:

1 Atividade Anti-Complemento na Saliva de Flebotomíneos e outros Insetos Hematófagos

2 A Saliva de Insetos Hematófagos
Estudada e utilizada para fins medicamentosos: sanguessugas e sangrias; restabelecimento da microcirculação. Proteínas da saliva do inseto desencadeiam defesa imunológica localizada Células de defesa liberam histamina Inflamação:pele vermelha e coceira Inseto morde

3 Particularidades da Saliva de Alguns Animais Hematófagos:
Sanguessugas: conseguem parasitar o hospedeiro por horas sem que haja coagulação do sangue hirudina - liga-se à trombina Carrapatos: conseguem driblar o sistema imune. proteínas na saliva que se ligam à histamina Flebotomíneos: alimentam-se o suficiente por pouco tempo. ao morder o hospedeiro, o inseto secreta substâncias vaso dilatadoras. O hospedeiro ficará ciente do parasita em poucos segundos.

4 PARASITA TIPO DE DROGA PODERIA SER USADA PARA...
Sanguessuga Diminui a viscosidade Prevenção da coagulação do sangue do sangue após cirurgias. Carrapato Anti-inflamatórios Tratamento de conjuntivite, asma. Flebotomíneos Vacinas Prevenção da leishmaniose.

5 Sistema do Complemento
um dos principais efetores da imunidade humoral, importante mecanismo efetor da imunidade inata, são proteínas plasmáticas e de superfícies celulares que se interagem entre si e com algumas células de modo altamente regulado, as duas principais vias de ativação são a Via Clássica e Via Alternativa.

6 A Via Clássica É ativada por certos isotipos de anticorpos ligados a antígenos. É iniciada pela ligação da proteína C1 do complemento nos domínios CH2 das moléculas de IgG ou dos domínios CH3 das moléculas de IgM ligadas a antígenos.

7 A Via Alternativa É ativada nas superfícies das células dos microrganismos. Resulta na proteólise de C3 e na inserção de seu produto de degradação C3b às superfícies microbianas, sem o papel de anticorpo.

8 A “Via Comum”

9 Funções do Complemento
opsonização e fagocitose, estimulação das respostas inflamatórias, citólise mediada pelo complemento.

10 Ensaio da Ação Salivária nas Vias Clássica e/ou Comum da Cascata do Complemento
Objetivo estudo da cascada do complemento pela ativação da via clássica, mantendo a via alternativa inativada. Metodologia 1) Opsonização de eritrócitos de ovelha: Opsonização com anticorpos anti-eritrócitos de ovelha

11 2) Hemólise e leitura: a) 50l de soro humano foi diluído em GBH²+ adição de 25l de solução de saliva; eritrócitos sensibilizados; d) centrifugação (1700 g por 30s); e) transferência de 200l do sobrenadante para uma placa de ELISA; medição das hemólises: Total Espontânea Na presença do complemento sem saliva

12 Resultados: Lu. longipalpis - curva de inibição da via clássica do complemento é sigmoidal. Lu. migonei - gráfico de inibição da via clássica do complemento apresenta padrão retilíneo. Triatomíneos

13 Discussão: Diferença poderia estar relacionada com a ação de moléculas inibitórias da saliva destes insetos.

14 Ensaio da ação de saliva na via alternativa e/ou comum na cascata do complemento
Preparação dos eritrócitos de coelho: eritrócito lavado 3x em GHB – EDTA armazenado a 4°C por uma semana dia do experimento: lava-se os eritrócitos 3x Mg – EGTA Ensaio: soro humano (50 ml) diluído em Mg – EGTA  90% hemólise 25 ml de saliva (procedimento idêntico ao descrito no ensaio da via clássica) Procura por hemolisina na saliva de flebotomínio protocolo da via clássica: soro humano foi substituído por solução salina usado 20 lobos de glândula salivar em cada teste Lu. longipalpis e Lu. migonei

15 Resultados Teste da inibição da via alternativa do sistema do complemento: + Lu. longipalpis - Lu. migonei Ausência de hemolisina, nas duas espécies, que poderia interferir no ensaio (a maior concentração usada foi incapaz de provocar hemólise)

16 poderia explicar a transmissão de Leishmania por insetos
Discussão A saliva de Lu. longipalpis tem aproximadamente a mesma potência de inibir tanto a via clássica quanto a alternativa do sistema do complemento, desde que a taxa entre as quantidades (requerida para promover 100% de inibição). de soro e saliva nos ensaios seja a mesma A saliva de alguns insetos interfere no sistema do complemento poderia explicar a transmissão de Leishmania por insetos

17 Caracterização da natureza química do fator inibitório da Via Clássica
Ensaio da inativação por aquecimento: incubação da saliva de Lu. longipalpis em banho maria (~100ºC) por 10, 30 e 60 min. Após isso, foram realizados ensaios de hemólise pela Via Clássica.

18 Ensaio de digestão pela proteinase K: uma amostra de saliva foi incubada com proteinase K. Após a incubação e diluição com soro fetal bovino foi realizado ensaio de hemólise pela Via Clássica. Avaliação do peso molecular do fator inibitório da Via Clássica: ultrafiltragem de saliva em membranas cujo “limite de corte” era de , , e 5.000Da. Após isso foi realizado ensaio de hemólise pela Via Clássica com as três amostras de saliva ultracentrifugada.

19 Resultados: a saliva incubada com proteinase K perde sua atividade inibitória  trata-se de uma proteína. trata-se de uma proteína de peso molecular entre 10 – 30kDa. fator inibitório do complemento bastante termoestável, pois resiste por mais de 1 hora a 100ºC sem perder sua função  provavelmente apresenta alto número de pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína.

20 Ensaio da Inibição da Tripsina por Saliva de Lu. longipalpis
Tripsina de porco Tampão HEPES / HCl Saliva Substrato (BApNA) Medição por densidade óptica Resultados: Quantidade de saliva correspondente a 100 glândulas não inibe a atividade da tripsina

21 Ação do Soro Anti-saliva de Lu
Ação do Soro Anti-saliva de Lu. longipalpis no Efeito Inibitório da Saliva do Inseto na Via Clássica do Complemento Ensaio: Imunização dos hamsters com Lu longipalpis Coleta de sangue dos hamsters Inativação do soro dos animais Ensaio de hemólise Mistura da saliva com anticorpos Adição do complemento

22 Resultados: O soro anti-saliva não inativou significativamente a atividade inibitória da saliva de Lu. longipalpis na via clássica do complemento.

23 Discussão: Anticorpos da saliva de Lu longipalpis foram incapazes de inativar totalmente a atividade do inibidor do complemento. Baixa eficiência pode estar relacionada a propriedades imunossupressoras da saliva do flebotomíneo.

24 A proteína inibitória da via clássica e alternativa poderia fazer parte da composição de uma vacina dirigida contra algum componente imunomodulatório da saliva de Lu. longipalpis e outros flebotomínios.

25 Referências Bibliográficas:
CAVALCANTE, R. R., PEREIRA, M. H., GONTIJO, N. F. Anti-complement activity in the saliva of phlebotomine sand flies and outher haematophagous insects. Parasitology (2003) 127, 87 – 93. CLAYTON, J. Wanted: bloodsuckers. NewScientist – 13 de julho de 2002, 42 – 45. ABBAS, A . K., LICHTMAN, A . H., POBER, J. S. Imunologia Celular e Molecular, Quarta Edição, Editora Revinter, 2003.

26 Ana Cristina Munhoz; Marcela Oliveira Faria; Patrícia Rosa de Araújo; Paula Fernandes dos Santos; Raquel Coelho Loures Fontes. Ciências Biológicas – UFMG.