IQB201 – Bioquímica Básica I

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1 IQB201 – Bioquímica Básica I
Sequenciamento de Proteínas Joab Trajano Silva Instituto de Química/UFRJ

2 Sequenciamento de Proteínas
A sequencia de aminoácidos de uma proteína pode ser determinada pelo sequenciamento de Edman, a partir da determinação da ordem dos aminoácidos na cadeia peptídica, ou inferida a partir da sequencia de DNA do gene.

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4 Preparo da Proteína para o Sequenciamento
Determinar o número e tipos de subunidades presentes na proteína Clivar as pontes de enxofre (se houver) Purificar cada uma das subunidades Determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade Determinar o resíduo N-terminal

5 I. Redução das Pontes Dissulfeto

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8 II. Composição de Aminoácidos da Proteína

9 II. Composição de Aminoácidos da Proteína

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11 Completa destruição de Trp
Perda parcial de Ser, Thr e Tyr Não destingue Glu de Gln e Asp de Asn

12 Hidrólise Alcalina A hidrólise alcalina é realizada em NaOH a 100°C por 4-8h Decomposição de Cys, Ser e Thr Desaminação e racemização de outros aminoácidos Permite a quantificação de Trp

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15 Determinação do Resíduo N-terminal

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17 Análise do N-terminal (Edman)

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20 C-terminal Análise por Carboxipeptidase

21 Separação dos aminoácidos por HPLC

22 Leucina aminopeptidase: Análise do N-terminal

23 Separação dos Aminoácidos Liberados

24 Sequenciamento da Cadeia Polipeptídica
Fragmentar a cadeia polipeptídica em locais específicos de modo a gerar peptídeos pequenos o suficiente para serem sequenciados diretamente Purificar cada fragmento Determinar a sequencia de aminoácidos de cada fragmento purificado Repetir as etapas anteriores usando peptídeos obtidos a partir do uso de outro método de clivagem

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