World J Gastroenterol Oct 14;14(38):

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1 World J Gastroenterol. 2008 Oct 14;14(38):5810-5.
Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vector-mediated transfer of normal epithelial cell specific-1 gene Wei Huang, Xiang-Long Tian, Yun-Lin Wu, Jie Zhong, Li-Fen Yu, Sheng-Ping Hu, Biao Li World J Gastroenterol Oct 14;14(38): Universidade de Brasília Estudantes: Carolina Fumico 09/ Inaê Aquino / Luana Lima / Paula Margotto 09/ Brasília, 17 de janeiro de 2011

2 Huang W, Tian XL, Wu YL, Zhong J, Yu LF, Hu SP, Li B.
ARTIGO INTEGRAL Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vector-mediated transfer of normal epithelial cell specific-1 gene. Huang W, Tian XL, Wu YL, Zhong J, Yu LF, Hu SP, Li B. World J Gastroenterol Oct 14;14(38): PMID: [PubMed - indexed for MEDLINE]Free PMC ArticleFree text

3 Câncer Gástrico Câncer gástrico é a maior causa de morte por doenças malignas (Nakamura, 1992cancer). Diagnostico tardio – biopsia. Desenvolvimento do câncer: - mucosa; camadas seguintes ; ultrapassa as paredes do estômago (atinge pâncreas e baço); metástases Tratamento : ressecção (gastrectomia); quimioterapia e radioterapia tem pouca eficiência ; terapia gênica.

4 Terapia gênica Consiste em adicionar fatores genéticos que possam suprir deficiências ou até mesmo inibir a expressão de certos genes nas células-alvo, servindo de tratamento para diversas doenças. O vetor, no caso, baculovírus, é administrado diretamente ao paciente, permitindo, dessa forma, uma interação in vivo entre o fator genético e as células-alvo. o

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6 Introdução Baculovírus - promissores na terapia gênica, pois: entra mas não se reproduzir em mamíferos, transgenes grandes podem ser acomodados, altos níveis de expressão de gene recombinante. NES1 – gene supressor de tumor, é provável que funcione como um regulador extracelularmente do crescimento celular. GFP – proteína fluorescente verde, permitindo a detecção da sua expressão com microscopia de fluorescência.

7 Objetivo do artigo Estudar o efeito inibitório do baculovírus mediado pelo gene de células epiteliais normais específicas (NES1) em câncer gástrico in vitro e in vivo - terapia gênica.

8 Esquema Construção do vetor recombinante
Infecção das células CG com Bac-GFP Infecção das células CG com Bac-NES1 Verificar a expressão de GFP Western blot Ensaio de proliferação(in vitro) Nude mice com tumor de células CG Bac-GFP e Bac-NES1 Estudos in vivo e imunohistoquímica

9 Construção de vetores recombinantes de baculovírus
Método Plasmídeo de baculovírus pFBGFPR – Instituto de Biologia Molecular da Universidade de Hong Kong pCMV-NES1 – Divisão da Biologia do Câncer do Departamento de Radioterapia, New England Medical Center Bac-to-Bac (Invitrogen)

10 Sistema Bac-to-Bac de acordo com o manual padrão (Invitrogen).

11 Construção de vetores recombinantes de baculovírus
Resultados Derivado do vetor baculovírus contendo o gene de interesse NES1 com o promotor CMV. Propagação de Bac-NES1 e Bac-GFP em células de inseto Spodoptera frugiperda (Sf-9).

12 Cultura de linhagens de células e incubação com o vetor
Método SGC-7901 foram preservadas e mantidas em RPMI 1640 com 10% de FBS. Sf-9 foram cultivadas a 27ºC em um frasco de cultura contendo Sf900 II(Gibco), suplementado com 10% de FBS. SGC-7901 foram semeadas e depois de 1 dia a cultura foi infectada com diferentes MOI de Bac-GFP. Cultura foi examinada para expressão de GFP por microscopia de fluorescência

13 Cultura de linhagens de células e incubação com o vetor
Resultados As células transfectadas com Bac-GFP (MOI=200) 24h após foram examinadas por microscopia de fluorescência, mostrando que as células SGC-7901 podem ser infectadas com baculovírus.

14 Expressão de NES1 nas células tumorais pela Bac-NES1
A expressão de NES 1 foi comprovada com western blot Eletroforese em gel(separa as proteínas por tamanho) Transferência para membrana de nitrocelulose membrana colocada face-a-face com o gelcorrente elétrica então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel. Bloqueio(ligações não específicas ) leite Anticorpo primário (membrana incubada overnight ) Anticorpo secundário (1h) Quimioluminescencia foi detectada e analisada

15 Consultem o artigo integral

16 Expressão de NES1 nas células tumorais pela Bac-NES1
Resultado Comprovação de que o gene estava sendo expresso nas células tumorais. Análise de western blot, mostrando a expressão de NES1 em celulas do tumor Resultado: 1 proteína na banda 43 kDa

17 Ensaio de proliferação de SGC-7901 (in vitro)
Placas com células tumorais (SGC-7901) Bac-NES Bac GFP PBS Quantificado o crescimento celular por absorbância Infectado com Infectado com Tratado com

18 Estudos de enxerto de tumor in vivo
Objetivo : Estudar o efeito inibitório do gene NES1 no crescimento do tumor nos nude mice enxertados com GC Nude mice: devido a uma modificação genética o camundongo não tem o timo, apresentando uma deficiência no sistema imunológico.

19 Estudos de enxerto de tumor in vivo
Método: Foram usados nude mice com 5 semanas obtidos da Shanghai Experimental Animals Centre of Chinese Academy of Sciences As células SGC-7901 foram injetadas subcutanêamente no flanco dorsal de cada camundongo Conforme o tumor foi crescendo, ele foi cortado em pequenos pedaços e re-implantados no flanco dorsal de cada camundongo Isso foi feito mais de três vezes e quando o tumor estava palpável os camundongos foram divididos em três grupos e foi injetado baculovírus contendo: Bac-NES PBS Bac-GFP * foi aplicado diretamente no tumor durante 3 dias

20 Estudos de enxerto de tumor in vivo
O peso e o volume do enxerto foi medido de forma aleatória com um “ calliper” a cada três dias durante 3 semanas de tratamento Após a terapia, o camundongo foi sacrificado e o tecido do tumor foi fixado com formol 10% para o próximo teste

21 Estudos de enxerto de tumor in vivo
Resultados O crescimento do tumor foi significativamente inibido por Bac-NES1(42,3%) comparando com os outros grupos. Foi observado diferença significante no volume do tumor a partir do 9˚ dia; Os outros dois grupos não obtiveram diferença significativa entre si

22 Expressão do GFP Objetivo: Verificar se baculovírus podem ser infectados in vivo Resultado: Só teve expressão das células com GFP na letra A, então o enxerto com o tumor podem ser infectados com o baculovírus

23 Imunohistoquímica Objetivo: Avaliar a expressão de NES1 em SGC-7901 xenografts Método: Os tecidos fixados com formol foram desparafinizados, rehidratados e lavados com PBS Depois de incubados com 3% H2O2 por 10 minutos a temperatura ambiente, o antigeno foi ativado As secções foram cobertas com soro animal por 20 minutos e incubadas com anticorpo policlonal NES1 de coelho a 4˚C durante a noite Então foram tratadas com EnVision kit por 30 minutos a temperatura ambiente As secções foram visualizadas por diaminobenzidina e contrastada com hematoxilina Controle negativo: anti-corpos primários TBS foram substituidos por TBS Os cortes foram observados no microscópio

24 Imunohistoquímica Resultados: O tumor tratado com Bac-NES1 exibiu uma expressão de NES1 significativamente maior que os outros tratados com Bac-GFP e PBS. Isso sugere que redução do crescimento do tumor e tamanho deve estar associado com o aumento da expressão do gene NES1.

25 Análise estatística Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados foram analisados utilizando o sofware SPSS 10.0 (Chicago, EUA).

26 Conclusão O estudo da terapia gênica mediada por gene NES1 no câncer gástrico, mostrou-se eficiente para a inibição do crescimento do tumor. Maiores estudos são necessários para avaliar reações sistêmicas, afeitos adversos e possíveis problemas de resposta imunológica. Estratégia potente para tratamento de CG

27 Bibliografia http://www.ghente.org/ciencia/terapia/index.htm