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Derivação de Células Germinativas e gametas Masculinos de Células Somáticas embrionárias GEIJSEN, N.; HOROSCHAK, M.; KIM, K.; GRIBNAU, J.; EGGAN, K.; DALEY,

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1 Derivação de Células Germinativas e gametas Masculinos de Células Somáticas embrionárias GEIJSEN, N.; HOROSCHAK, M.; KIM, K.; GRIBNAU, J.; EGGAN, K.; DALEY, G. D. NATURE, 427 (8), 2004.

2 INTRODUÇÃO Metodologia X Célula Tronco (ES) Corpos embrióides (EB) mRNA RT-PCR Genes marcadores de ES: -Oct4 (POU domain) - stella - fragilis

3 Diferencial entre células ES em EBs - Diminuição das expressão de stella e Fgls a partir do dia 3. - ES se desenvolve para EB a partir do dia 9. - Dazl só é expresso em EB de ovário e testículo. - Piwil, Rnf17, Rnh2, Tdrd1 e Tex14 é específico para EB de testículo.

4 Cél ES Protocolo de transformação + EB Raras: testículo? Es não diferenciadas? Céls. Germinativas? Células ES estão marcadas com anticorpo contra receptor de membrana SSEA-1, ou, estas são diferenciadas por carregarem um promotor de Oct4 grudado a uma proteína verde fluorescente (GFP) translocada de um plasmídio. As células que permanecem verdes são germinativas primordiais (PGC). Oct4 <1% Oct4

5 Marcadores de diferenciação Cél. ES Ocorre diferenciação Fibroblasto embrionário de camundongo PGC Ocorre proliferação celular Ác.R. Fosfatase Alcalina Não resta células vivas Fosfatase alcalina Ilhas coradas circundadas por células móveis que lembram PGCs migratórias. 7 dias

6 Expressão de PGC depois de 7 dias

7 Comprovar que as células que derivam das ES são PGCs Gene Igfr2 expresso no alelo feminino Igfr-2Gene E mmm expressão ES Ác.R 5 dias SSEA+ Magnetic beads EBPGC Meio especial p/ cél. germ. emb. clones

8 Expressão gênica dos clones - PvuII: corta o DNA genômico dos clones onde está o marcador da sonda. - MluI: corta onde há metilação do gene. PvuII m MulI H19/Igf2

9 Falta de expressão de Igl2r depois do dia 5

10 Expressão gênica de PGCs desenvolvidas de EBs (SSEA+) separadas por imunomagnetic bead. Demonstra fenotipicamente e biologicamente propriedades de PGCs desenvolvidas in vivo

11 Diferenciação de PGC em gametas EB 5 dias Ác.R PGC Expressão de Gnf no dia 7 janela de oportunidade ??? Expressão de Sry Gônada * Dia 11: Expressão de genes associados ao desenvolvimento de células germinativas masculinas (Acrossina e Haprina). * Acrossina: complexo acrossomal * Haprina: espermatogênese * Detectou células de suporte do estroma (Leydig e Sertoli) pelo R-LH e MIS ( Subst. Inibidora Mulleriana) * Falha no desenvolvimento de gametas femininos: não detectou proteínas da zona pelúcida.

12 Expressão de Sry de EBs desenvolvidas * Sry: gene masculino que determina o desenvolvimento germinativo. Início da expressão no dia 4.

13 Expressão de Acrosina e Haprina em PGCs Expressão de LH-R e MIS

14 Detecção de oócitos nos clones de PGCs. * Genes de detecção de células da zona pelúcida (Zp1, Zp2 e ZP3).

15 Comparação de expressão de 2 genes de diferenciação de cél. germ. masculinas ES EB AZ1 Rfp Gameta Y ES + EB XXXX Gameta X

16 Detecção de meiose em PGCs atrvés de anticorpo FE-JI comparando com o testículo

17 Descobrir a quantidade de células meióticas das PGC * Anticorpo para reconhecer células meióticas masculinas - FE-JI ( marca acrossomo anterior de espermatócitos no paquíteno e espermátides redondas; coloração vermelho *Hoechst - DNA; coloração azul

18 Investigação da função biológica de PGC derivada de EB Oócito + PGC 20% de blastocistos Se desenvolveriam normalmente de pois de implantados no útero Microinjeção

19 Proporção de cromossomos sexuais XX e XY * Utilizou hibridização de fluorescência in situ (FISH) * Os alelos estão marcados e o X também. X*X* A*A* X*Y A*A*

20 CONCLUSÃO * Ebs não refletem a precisamente temporal e espacialmente o desenvolvimento de um embrião, mas sua dervação de células ES, in vitro, prova valores na diferenciaçaõ de tecidos, licando deleções genômicas e expressão transgênica ectópica. * Os EB suportam a pprogramaçõa de diferenciação de células germinativas masculinas, culminando na formação de células haplóides que manifesta sua morfologia e potencial de fertilização de células germinativas haplóides masculinas e envolvidas por espermátides. *A demonstração de formação de oócitos e espermatozóides a partir de células ES são novas possibilidades para investigação de desenvolvimento de células germinativas, reprogramação epigenética e modificação genética de linhagem germinativas.


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