Derivação de Células Germinativas e gametas Masculinos de Células Somáticas embrionárias GEIJSEN, N.; HOROSCHAK, M.; KIM, K.; GRIBNAU, J.; EGGAN, K.;

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1 Derivação de Células Germinativas e gametas Masculinos de Células Somáticas embrionárias GEIJSEN, N.; HOROSCHAK, M.; KIM, K.; GRIBNAU, J.; EGGAN, K.; DALEY, G. D. NATURE, 427 (8), 2004.

2 INTRODUÇÃO Metodologia X Célula Corpos Tronco (ES) embrióides (EB)
Genes marcadores de ES: -Oct4 (POU domain) - stella - fragilis mRNA RT-PCR

3 Diferencial entre células ES em EBs
- Diminuição das expressão de stella e Fgls a partir do dia 3. - ES se desenvolve para EB a partir do dia 9. - Dazl só é expresso em EB de ovário e testículo. - Piwil, Rnf17, Rnh2, Tdrd1 e Tex14 é específico para EB de testículo.

4 + Oct4 Protocolo de transformação <1% EB Cél ES Raras: testículo?
Es não diferenciadas? Céls. Germinativas? Oct4 Células ES estão marcadas com anticorpo contra receptor de membrana SSEA-1, ou, estas são diferenciadas por carregarem um promotor de Oct4 grudado a uma proteína verde fluorescente (GFP) translocada de um plasmídio. As células que permanecem verdes são germinativas primordiais (PGC).

5 Marcadores de diferenciação
PGC Ocorre proliferação celular Cél. ES Ocorre diferenciação Ác.R. Ác.R. 7 dias Fibroblasto embrionário de camundongo Fosfatase alcalina Fosfatase Alcalina Ilhas coradas circundadas por células móveis que lembram PGCs migratórias. Não resta células vivas

6 Expressão de PGC depois de 7 dias

7 Comprovar que as células que derivam das ES são PGCs
Gene Igfr2 expresso no alelo feminino m m m E Igfr-2 Gene expressão EB PGC clones ES Ác.R Meio especial p/ cél. germ. emb. 5 dias SSEA+ Magnetic beads

8 Expressão gênica dos clones
- PvuII: corta o DNA genômico dos clones onde está o marcador da sonda. - MluI: corta onde há metilação do gene. m PvuII PvuII MulI H19/Igf2

9 Falta de expressão de Igl2r depois do dia 5

10 Expressão gênica de PGCs desenvolvidas de EBs (SSEA+) separadas por imunomagnetic bead.
Demonstra fenotipicamente e biologicamente propriedades de PGCs desenvolvidas in vivo

11 Diferenciação de PGC em gametas
EB PGC Expressão de Gnf no dia 7 janela de oportunidade??? 5 dias Ác.R Expressão de Sry Gônada * Dia 11: Expressão de genes associados ao desenvolvimento de células germinativas masculinas (Acrossina e Haprina). * Acrossina: complexo acrossomal * Haprina: espermatogênese * Detectou células de suporte do estroma (Leydig e Sertoli) pelo R-LH e MIS ( Subst. Inibidora Mulleriana) * Falha no desenvolvimento de gametas femininos: não detectou proteínas da zona pelúcida.

12 Expressão de Sry de EBs desenvolvidas
* Sry: gene masculino que determina o desenvolvimento germinativo. Início da expressão no dia 4.

13 Expressão de Acrosina e Haprina em PGCs
Expressão de LH-R e MIS

14 Detecção de oócitos nos clones de PGCs.
* Genes de detecção de células da zona pelúcida (Zp1, Zp2 e ZP3).

15 Comparação de expressão de 2 genes de diferenciação de cél. germ
Comparação de expressão de 2 genes de diferenciação de cél. germ. masculinas ES ES + EB EB AZ1 X Rfp Gameta Y Gameta X

16 Detecção de meiose em PGCs atrvés de anticorpo FE-JI comparando com o testículo

17 Descobrir a quantidade de células meióticas das PGC
* Anticorpo para reconhecer células meióticas masculinas - FE-JI ( marca acrossomo anterior de espermatócitos no paquíteno e espermátides redondas; coloração vermelho *Hoechst - DNA; coloração azul

18 Investigação da função biológica de PGC derivada de EB
Microinjeção + Oócito PGC 20% de blastocistos Se desenvolveriam normalmente de pois de implantados no útero

19 Proporção de cromossomos sexuais XX e XY
* Utilizou hibridização de fluorescência in situ (FISH) * Os alelos estão marcados e o X também. X*X* A*A* X*Y A*A*

20 CONCLUSÃO * Ebs não refletem a precisamente temporal e espacialmente o desenvolvimento de um embrião, mas sua dervação de células ES, in vitro, prova valores na diferenciaçaõ de tecidos, licando deleções genômicas e expressão transgênica ectópica. * Os EB suportam a pprogramaçõa de diferenciação de células germinativas masculinas, culminando na formação de células haplóides que manifesta sua morfologia e potencial de fertilização de células germinativas haplóides masculinas e envolvidas por espermátides. *A demonstração de formação de oócitos e espermatozóides a partir de células ES são novas possibilidades para investigação de desenvolvimento de células germinativas, reprogramação epigenética e modificação genética de linhagem germinativas.