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Sensing DNA Damage Through ATRIP Recognition of RPA-ssDNA Complexes Lee Zou and Stephen J.Elledge Science, 300 (6): 1542-1548. 2003 Apresentação: Sílvia.

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1 Sensing DNA Damage Through ATRIP Recognition of RPA-ssDNA Complexes Lee Zou and Stephen J.Elledge Science, 300 (6): Apresentação: Sílvia Neto Jardim

2 Quando o DNA de uma célula está danificado não é interessante para ela continuar ciclando normalmente. Em geral quando há o dano ao DNA a ATR (ATM-Rad3-related protein kinase) fosforila substratos como a p53, chk1, Rad17, BRCA1; que em conjunto inibem a replicação, a mitose e promove o reparo do DNA e a apoptose. DNA DAMAGECELL CYCLE ATR P P P p53 P brca1 P Chk1 P rad17 P replicação mitose reparo apoptose

3 Mecanismos pelos quais a ATR é ativada quando há o dano ao DNA ainda são desconhecidos. Sabe-se que ela forma um complexo com a proteína ATRIP(ATR-ATRIP). Um provável candidato a sinalizador de DNA danificado é o ssDNA, que sempre está associado à proteina RPA (Replication Protein A); que está envolvida no checkpoint em várias situações. Objetivo: estudar se a RPA está envolvida no reconhecimento do dano ao DNA, na ativação do complexo ATR-ATRIP, ou em ambos.

4 Objetivo: verificar se RPA está associada a ssDNA gerado por radiação UV. Experimento: cromatina de cél. humana foi exposta a UV e a associação da RPA com a cromatina foi avaliada com immunoblotting. Depois de exposição a UV foi verificado uma aumento na quantidade de RPA34. Conclusões: a RPA está associada ao ssDNA.

5 O: determinar se a RPA se colocaliza com o complexo ATR-ATRIP após o dano ao DNA. E: por immunostaining a localização de RPA e ATR-ATRIP em céls não danificadas e em céls tratadas com IR (Ionizing Radiation) foi analisada. 2 horas após irradiação RPA e ATR se colocalizaram (pontos amarelos), o que não foi observado em células não irradiadas. C: RPA e ATR-ATRIP são recrutadas ao mesmo local quando há dano ao DNA.

6 O: determinar se a RPA é exigida para a ativação de ATR quando há dano ao DNA. E: siRNA foi usado para inibir a expressão de RPA70 em cels HeLa transfectadas. Por immunoblotting observou-se que houve diminuição de RPA70 mas não de ATR nessas cels. C: RPA não atua diretamente em ATR.

7 O: determinar se a RPA é exigida para o recrutamento de ATR-ATRIP para a região do DNA danificado E: foi analisada a localização de ATR- ATRIP em cels transfectadas com siRNA RPA70. Apenas 4% das cels transfectadas com siRNA-RPA70 apresentaram formação de ATR-ATRIP foci (pontos). C: o recrutamento do complexo ATR- ATRIP é dependente de RPA quando o DNA está danificado.

8 O recrutamento de ATR-ATRIP à região de dano no DNA parece estar envolvida na sinalização de checkpoint. Chck1 é um substrato de ATR-ATRIP sendo fosforilado na Ser345 em resposta ao dano de DNA. O: determinar se a fosforilação de Chk1 é dependente de RPA. E: cels HeLa foram transfectadas com siRNA-RPA70 e a fosforilação de chk1 foi induzida com HU (Hidroxiuréia) em A e por UV em B. Por immunobloting com Ab-P-Ser345 observou-se que nestas cels a fosforilação de Chk1 diminuiu 75%. C: RPA é exigida para fosforilação de Chk1.

9 O: verificar se a fosforilação de Chk1 dependente de RPA é célula dependente. E: cels U2OS foram transfectadas com siRNA RPA70 e a fosforilação de Chk1 foi induzida com UV. Nestas cels a fosforilação de Chk1 diminuiu. C: a fosforilação de Chk1 em resposta ao dano no DNA é dependente de RPA e independente do tipo celular.

10 O: verificar se RPA estimula a ligação de ATRIP ao ssDNA in vitro. E: ATRIP recombinante foi incubada com oligômeros (ssDNA) biotinilados em presença/ausência de RPA. Em ausência de RPA (lane 2) a ATRIP não se associa aos oligômeros. Em presença de RPA ATRIP se liga eficientemente aos olig. A SSB (E. coli ssDNA Binding protein) não estimulou a ligação de ATRIP ao ssDNA. C: RPA auxilia ATRIP a se ligar ao ssDNA in vitro.

11 Em leveduras Ddc2, homóloga a ATRIP, se liga a dsDNA. O: verificar se ATRIP se liga a dsDNA. E: oligômeros biotinilados foram anelados com seus complementares (dsDNA) e incubados com ATRIP. A ATRIP não se ligou a dsDNA em ausência de RPA (lane4). C: Em presença de RPA a ATRIP se liga eficientemente a ssDNA e muito pouco a dsDNA. Provavelmente há contaminação de ssDNA nas amostras de dsDNA.

12 O: confirmar se ATRIP se liga a outros tipos/seqüências de DNA. M13 (ss), supercoiled (ds) e linearizado (ds) foram usados como competidores da ligação RPA-ATRIP-ssDNA E: competidores foram incubados com ssDNA, RPA, ATRIP. Apenas M13 inibiu a ligação de ATRIP ao ssDNA. C: RPA confere afinidade de ATRIP a ssDNA, não a dsDNA independente da sua seqüência.

13 O: determinar se o tamanho do ssDNA é importante para ligação de ATRIP. E: comparação da ligação de ATRIP a diferentes tamanhos de oligômeros (ssDNA) biotinilados: 25, 50 e 75 nt, em presença de RPA. Quando numero de moles igual foi usado nas reações, o olig de 75nt reteve mais ATRIP que os outros. Quando massa igual foi usada nas reações o olig de 75nt reteve mais ATRIP que os outros. C: A ligação de ATRIP a ssDNA em presença de RPA é tamanho dependente com threshold entre 50 e 75. A RPA ocupa ~30nt e apenas o oligômeros com 75nt teria capacidade de ligar mais de um complexo RPA. A ligação do RPA estimula o recrutamento da ATRIP.

14 O: verificar se a RPA pode estimular a ligação do complexo ATR-ATRIP ao ssDNA in vitro. E: oligomeros de 75nt (ssDNA) foram incubados com ATR, ATRIP ou o complexo ATR-ATRIP em presença/ausência de RPA e revelados com Ab. C: in vitro ATR se liga ao ssDNA independente da presença de RPA; ATRIP se liga ao ssDNA somente em presença de RPA; O complexo ATR-ATRIP só se liga ao ssDNA somente em presença de RPA.

15 A capacidade de ATR de se ligar a ssDNA em ausência de RPA sugere que a ATR pode ser capaz de sinalizar sozinha o dano no DNA. O: verificar se ATR é capaz de sinalizar o dano ao DNA em ausência de ATRIP e RPA in vivo E: a quantidade de ATR livre nas cels foi medida. 3 rodadas de imunoprecipitação com Ab-ATRIP foram realizadas e o ATR restante nos extratos foi medido. 95% do ATR foi removido na imunoprecipitação com Ab- ATRIP. C: A maior parte de ATR nas cels está formando um complexo com ATRIP e provavelmente sozinha não sinaliza o dano no DNA.

16 O: verificar se o recrutamento do complexo ATR-ATRIP estimula a fosforilação dos substratos de ATR. E: Sistema baculovirus para expressar Rad17 recombinante. Ab-rad17 e Ab- Ser635 (aa fosforilado de rad17) foram usados. Em ausência de ATR-ATRIP ou de RPA o rad17 não é fosforilado. Em presença de ATR-ATRIP e RPA o rad17 é fosforilado. C: O recrutamento de ATR-ATRIP em presença de RPA permite a fosforilação de seus substratos.

17 O modelo usado neste trabalho é o humano mas a função de recrutamento de ATR-ATRIP in vivo pela RPA deve ser conservada entre eucariotos. Um sistema em leveduras no qual a RPA é expressa ligada a um tag degron (td) e é degrada a 37°C foi elaborado para examinar a exigência de RPA em leveduras para o recrutamento de Ddc2 (homólogo de ATRIP). O: comprovar que RPA-td se degrada a 37 °C. E: immunoblotting com Ab-RPA e Ab-RPA-td. C: A RPA-td se degrada após 60 a 37°C.

18 O: determinar se o recrutamento de Ddc2 é dependente de RPA1. E: sistema RPA1-td foi usado. No controle tanto RPA1 quanto Ddc2 foram recrutadas para a região de quebra dupla do DNA (HO). Nas cels expressando RPA1-td, pouca RPA1-td e Ddc2 foram recrutadas para a área do dano. C: O recrutamento de Ddc2 para a região de quebra dupla do DNA é dependente de RPA1.

19 A quebra do DNA gera ssDNA, o que de acordo com a literatura está relacionado a ativação do checkpoint por dano no DNA. Este trabalho comprovou que ssDNA associado a RPA é capaz de ativar o complexo ATR-ATRIP que por sua vez fosforila substratos diversos que em conjunto levam ao checkpoint. Os autores sugerem um modelo: 1) quando há quebra de dsDNA em seguida há o surgimento de ssDNA e a RPA se associa a este, desencadeando o recrutamento do complexo ATR-ATRIP e conseqüentemente o checkpoint; 2) Nas forquilhas de replicação a RPA está sempre presente e quando há algum problema e as helicases e/ou polimerase se desassociam da fita de DNA um número maior de RPA se liga ao ssDNA o que gera um efeito sinergístico e causa o recrutamento do complexo ATR-ATRIP que desencadeia o checkpoint.

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