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Produção de Proteínas Recombinantes Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto Regente:Prof. Dra. Deolinda Lima Orientadora: Dra. Alexandra.

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1 Produção de Proteínas Recombinantes Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto Regente:Prof. Dra. Deolinda Lima Orientadora: Dra. Alexandra Gouveia Discentes: Andreia Pires Benedita Aguiar Benedita Aguiar Bruna Gonçalves Bruna Gonçalves Catarina Oliveira Catarina Oliveira

2 O que são proteínas recombinantes? São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados. Isto é, advêm da técnica de DNA recombinante. Para que servem? A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios em várias áreas: - saúde; - biologia; - bioquímica; - microbiologia; - genética; - biotecnologia; - agricultura; - etc.

3 Terapia génica Possibilidade de introdução de um gene num organismo e consequente correcção de doenças genéticas. Melhoramento animal e vegetal Plantas resistentes a pragas e a diferentes meios nutritivos. Animais de maiores dimensões, mais férteis e carne com maior qualidade. Criação de modelos animais Ideais para o estudo da estrutura, função e regulação de um gene, além de facilitar a compreensão da fisiopatologia da doença. Algumas aplicações

4 Técnica de produção de proteínas recombinantes Isolar e preparar o DNA; Escolher o vector apropriado; O fragmento de DNA a clonar é introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante. O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira – transformação, que possui mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese proteica; Selecção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante; Verificar se a proteína foi expressa; Remoção e purificação das proteínas. The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M..

5 Algumas enzimas envolvidas no processo EnzimasFunção Tipo II (endonuclease de restrição)Cortam os DNAs em sequências de bases específicas. DNA ligaseJuntam duas moléculas de DNA ou fragmentos. Taq DNA polimeraseAdiciona os nucleotídeos na extremidade 3´ da cadeia de DNA. Transcriptase reversaProduz uma molécula de DNA através de uma molécula de RNA. Enzimas de restrição- Endonucleases Enzimas de restrição- Endonucleases Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas recombinantes são normalmente gerados por digestão através de endonucleases de restrição. Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas recombinantes são normalmente gerados por digestão através de endonucleases de restrição.. Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 pares de bases.. Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 pares de bases.. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.

6 Vectores de clonagem Capaz de transportar uma sequência de DNA estranha dando origem a um DNA híbrido ou recombinante. Capacidade de se auto-replicar. Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos. Possuir locais de restrição únicos, polylinker. Fácil de purificar. Tipos de vectores de clonagem Plasmídeos (pBR322) Fasmídeos ou fagemídeos Cosmídeos Bacteriófagos λ YACs, BACs e PACs Livro2/C11/pbr322.html

7 Vectores de expressão Promotor Codão de iniciação seguido de polylinker Local de ligação ao ribossoma Promotor Local de ligação ao ribossoma Sítio de clonagem e sequência codificante de 6 histidinas

8 Transformação Ocorre quando uma célula incorpora e exprime um fragmento de material genético. Para a introdução do DNA recombinante podem ser utilizados vários métodos: Células competentes; Electroporação; Bombardeamento de DNA revestido de Tungsténio; Microinjecção; Transfecção. Modern Genetic AnalysisModern Genetic Analysis.

9 Extracção e purificação de proteínas Extracção lise celular Purificação Cromatografia de afinidade Lehningher Principles of Biochemistry

10 Tags moleculares de fusão Fusion TagImmobilized Ligand Binding ConditionsElution ConditionsAvailable Formats Glutathione (S- transferase(GS T) Reduced glutathioneNeutral (physiologic) pH, and non-denaturing; glutathione must be reduced and GST must be active Free reduced glutathione at neutral pH (competitor) Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, coated microplates Histidine-taggedChelated Nickel or Cobalt Neutral (physiologic) pH without reducing or oxidizing agents; small tag must be accessible in fusion protein structure; high ionic strength and denaturants (chaotropes such as 8 M urea) compatible. >200 mM Imidazole, low pH, or strong chelators Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, Swell- Gel Discs in 96-well filter plates, coated microplates Maltose Binding Protein (MBP) DextrinNeutral (physiologic) pH and non-denaturing; NaCl added to reduce nonspecific binding Maltose at neutral pH (competitor) Gel slurry, coated microplates Green Fluorescent Protein (GFP) Anti-GFP antibodyNeutral (physiologic) pH and non-denaturing Usual antibody/antigen elution buffers (e.g., low pH or chaotropic salts) Coated microplates

11 Proteínas Recombinantes

12 Exemplos de Proteínas Recombinantes Hormona de crescimento humano – a administração desta hormona durante a infância permite a correcção dos casos de nanismo. Anticoagulantes – activadores de tecido plasminogénio que por sua vez activam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques cardíacos). Dismútase do superóxido – previne danificação de tecidos quando este é exposto à falta de oxigénio. Anticorpos monoclonais – são usados em testes diagnósticos; transporte direccionado (drogas, toxinas, componentes radioactivos utilizados na terapia cancerígena), assim como outras aplicações. ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm

13 Referência cronológica Frederick Grant Banting descobre a insulina É produzida insulina humana recombinante Esta insulina é disponibilizada no mercado. Insulina

14 - Duas cadeias peptídicas- cadeia A e cadeia B. - Duas pontes dissulfureto entre as cadeias A e B e outra na própria cadeia A.

15 Insulina recombinante Insulina lispro Monómeros- Insulina é activa na forma de monómeros. Dímeros – pontes de hidrogénio entre as extremidades C da cadeia B. Hexameros – na presença de Zn 2+

16 Produção de insulina Insulina proveniente de suínos e bovinos Insulina humana biossintética Introduction to Genetic Analysis.

17 Β-gal Β-gal peptide Purify β-gal- insulin fusion proteins

18 X-PROT Unidade de investigação e desenvolvimento na área da biotecnologia molecular. Produção de proteínas recombinantes de interesse para a saúde humana. Desde 2003, 5 novas proteínas. Descoberta de proteína com enorme potencial para terapia do cancro. Prémio da Comissão Europeia em 2004.

19 Bibliografia "The Cell. A Molecular approach."- 3nd ed. G.M. Cooper, AMS Press, U.S.A "Molecular Biology of the Cell." - 4 nd ed., Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts and Watson, Garland Publishing, Inc. New York, Nelson D.L., Cox M.M.: Lehningher Principles of Biochemistry (4th Ed.). W.H. Freeman and Company, New York


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