Anomalias cromossômicas no início do desenvolvimento de embriões zebuínos produzidos in vitro RITA MARIA LADEIRA PIRES2, RAFAEL HERRERA ALVAREZ2, ANA.

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1 Anomalias cromossômicas no início do desenvolvimento de embriões zebuínos produzidos in vitro RITA MARIA LADEIRA PIRES2, RAFAEL HERRERA ALVAREZ2, ANA CRISTINA LIGORI2, LIA DE ALENCAR COELHO,2,3, ANTÔNIO CAMPANHA MARTINEZ2 Discente: Carolina de Souza Stuchi Docente: Dra. M. Tercília V. de A. Oliveira

2 INTRODUÇÃO Atualmente o Brasil ocupa um lugar de destaque no emprego de tecnologias relacionadas à transferência de embrião (TE). Finalidade principal: multiplicação de animais que apresentam características genéticas de alto valor de mercado. Líder Mundial: 25 mil transferências de embriões FIV por ano (Sociedade Internacional de Transferência de Embriões)

3 Introdução Melhora no processo de produção Uso de embriões FIV
Mortalidade embrionária precoce (abortos espontâneos); produção de bezerros “gigantes”; desvio da taxa de sexo (machos); problemas de saúde dos bezerros nascidos. Uso de embriões FIV Problemas Esses problemas têm sido atribuídos, entre outros, às alterações celulares de ordem genética e estrutural dos embriões. Existem evidências de que manipulações e/ou os métodos de cultivo in vitro provocam alterações estruturais e funcionais nos embriões.

4 Introdução Estudos mostram a existência de anomalias cromossômicas em embriões FIV e PIV bovinos de raças européias, mas não existem informações para as raças zebuínas. Considerando que as raças zebuínas representam a grande maioria da população bovina do Brasil e constituem o principal mercado das empresas de FIV no País, informações são importantes. Objetivo: caracterizar a incidência de alterações cromossômicas de embriões zebuínos FIV em diferentes estágios de desenvolvimento. ≠

5 MATERIAL E MÉTODOS Embriões FIV  
Ovários de fêmeas zebuínas (Nelore) foram coletados em um frigorífico  colocados em solução salina (NaCl a 0,9 %) + estreptomicina (100 μg mL-1) + penicilina (100 UI mL-1)  transportados ao laboratório em uma caixa térmica (30 a 35⁰C). Os oócitos foram aspirados dos folículos ovarianos no período de 4 h após o abate  lavados em meio H-199, constituído de TCM suplementado com Hepes (25 mM) + piruvato (2,73 mM) + sulfato gentamicina (50 μg mL-1) + soro fetal bovino (5%)  avaliados por critérios morfológicos (somente foram utilizados os que apresentaram um cumulus oophorus intacto).  

6 Material e Métodos Os oócitos selecionados foram colocados em meio B-199, constituído de meio TCM 199 suplementado com Hepes (16,79 mM) + bicarbonato de sódio (28,57 mM) + piruvato de sódio (2,73 mM) + sulfato de gentamicina (50 μg mL-1) + albumina sérica bovina-BSA (4 mg mL-1). Maturação dos oócitos: Colocados em meio B estradiol 17β (1 μg mL-1) + PMSG (20 UI mL-1) + hCG (10 UI mL-1)  incubação durante 24h em estufa (38,5⁰C e 5% de CO2). Fertilização in vitro: Após maturados, os oócitos foram lavados em meio H TALP-FIV e distribuídos em gotas sob óleo mineral. Cada gota formada de 70 μL de meio TALP-FIV-PHE + 10 μL de suspensão de espermatozóides à concentração de 10X106 mL μL de suspensão contendo oócitos  colocados por 18 a 21h em estufa (38,5⁰C e 5% de CO2) para a fecundação.

7 Material e Métodos Os oócitos (presumivelmente fecundados) foram lavados  transferidos para gotas de desenvolvimento, constituídas de 78 μL meio B-199-CEOB + 2 μL de fragmentos de células epiteliais de oviduto bovino + 20 μL de suspensão contendo 10 oócitos  foram cultivados em estufa nas mesmas condições. Ao alcançar os estágios de 2; 4; 8; 16 células e mórula compacta os embriões foram submetidos à análise citogenética.

8 Embriões PIV Material e Métodos
Os embriões foram obtidos de vacas Nelore superovuladas com FSH-LH. A lavagem dos cornos uterinos foi realizada por via cervical, no dia 7 após a inseminação (com sêmen do mesmo touro usado nos embriões FIV). Os embriões foram avaliados morfologicamente e em seguida foram submetidos ao processo de cariotipagem de forma semelhante aos embriões FIV. Utilizadas Mórulas Grau I e II produzidas in vivo como controle da incidência de anomalias cromossômicas.

9 Material e Métodos Análise cromossômica dos embriões
Os embriões foram cultivados durante 8 a 12 horas em meio TCM + soro fetal bovino (10%) + colchicina (0,03 μg mL-1)  transferidos para uma solução hipotônica de citrato de sódio 0,9% (10 minutos a 20⁰C). Fixados sobre uma lâmina, com metanol:ácido acético (3:1) e corados com Giemsa. A análise cromossômica foi realizada em microscópio óptico. Análise estatística de dados Teste de Quiquadrado (χ2) com correção de Yates.

10 Coloração Usual com Giemsa
Permite a visualização e classificação dos cromossomos por grupos de acordo com o tamanho e a posição do centrômero. Protocolo: Envelhecer as lâminas em estufa a 60⁰C por um dia; Hidrólise em HCl 1N a 60 ⁰ C por 7 minutos; Mergulhar as lâminas em água deionizada gelada; Lavar as lâminas em água destilada por 10 minutos; Levá-las a um borel com solução de tampão Sorensen de 1 a 2 minutos; Mergulhar as lâminas em uma solução de Giemsa tamponada a 2% por 5 minutos; Por fim, lavar as lâminas em água deionizada e colocá-las para secar.

11 RESULTADOS E DISCUSSÃO
29,9% (32/107)dos embriões FIV analisados apresentaram anomalias cromossômicas. Os embriões PIV (mórulas) apresentaram uma incidência de 13,0% (3/23). não evidenciaram diferenças significativas entre os diferentes estágios de desenvolvimento precoce do embrião bovino (Figura 1).

12 Resultados e Discussão
39,1% 32,1% 26,7% 25% 24,1% 13% Figura 1. Anomalias cromossômicas de embriões zebuínos FIV em diferentes estágios de desenvolvimento (MoPIV = mórulas produzidas in vivo)

13 Resultados e Discussão
Anomalias observadas: mixoploidia e poliploidia (para FIV e PIV). A mixoploidia apresentou diferentes rearranjos: n/2n; 2n/3n; 2n/4n, 3n/4n; Em mais de 80% dos casos existiu uma linhagem celular normal de 2n=60. A incidência de poliploidia (3n e 4n) dos embriões FIV: 0,9 % nos estágios de mórula; 10,3 % de 2 a 16 células. Sugere que o desenvolvimento de embriões poliplóides é menor e aparentemente reprimido a partir do terceiro ciclo celular.

14 Resultados e Discussão
As poliploidias podem ser explicadas por erros na fertilização: penetração de mais de um espermatozóide no óvulo; não expulsão do segundo corpúsculo polar; fertilização de um óvulo diplóide por um espermatozóide. Dos 32 embriões FIV que apresentaram anomalias: 19 (59,4%) eram do sexo feminino; 13 (40,6%) do masculino (Figura 2). Poderia eventualmente explicar o maior número de nascimento de bezerros machos oriundos de embriões FIV.

15 Resultados e Discussão
59,4% 40,6% Figura 2. Anomalias cromossômicas de embriões zebuínos FIV conforme o sexo do embrião

16 CONCLUSÃO Aproximadamente um terço dos embriões zebuínos FIV apresentam anomalias cromossômicas e sua incidência independe do estágio de desenvolvimento embrionário.

17 Obrigada!